特异性p38+MAPK抑制剂对哮喘气道黏液高分泌的抑制作用.pdfVIP

·25· MAPK抑制剂对哮喘气道 特异性p38 黏液高分泌的抑制作用 宋立强 吴昌归 李志奎张伟 张健王彩云 第四军医大学西京医院(西安710033) 气道黏液高分泌是哮喘的主要症状之一，是患者 同哮喘组。各组最后一次激发后24h内检测以下指 肺功能进行性恶化的独立危险因素。其病理基础是 标。 acid 气道上皮杯状细胞增生并合成大量黏蛋白MUCSAC。 Schiff，PAS)染 1．2．2高碘酸希夫(periodic 因此，探讨MUC5AC合成的分子机制及防治方法是色计数杯状细胞取各组小鼠肺组织，制备常规石蜡 近年哮喘研究的热点之一。p38丝裂原活化蛋白激 切片，脱蜡后行PAS特殊染色和苏木精衬染。杯状 activated 酶(p38mitogen proteinkinase，p38MAPK)细胞胞浆内富含的糖黏蛋白呈现亮紫红色颗粒，这是 是细胞内的主要信息传递分子，可将促炎因子等胞外 鉴定杯状细胞的传统方法。高倍显微镜下(400×) 刺激传递至胞核，从而诱导细胞的结构与功能变化。 随机选取6个管壁完整的小支气管截面，采用Image- Tool 目前的研究已证实，在培养气道上皮细胞的杯状细胞 3．0图像分析软件测量周径(Pi)，计数杯状细胞 数量增加、MUC5AC合成增多过程中，p38MAPK相数量(No)，计算单位长度周径的杯状细胞数量(No／ 关通路均扮演重要角色。但p38MAPK阻断剂的在Pi)进行半定量。 体作用效果还不太清楚。本研究拟以小鼠哮喘模型 1．2．3支气管肺泡灌洗液的收集及ELISA法检 为研究对象，探讨p38MAPK特异性阻断剂SB203580测MUCSAC含量①收集：各组小鼠麻醉后，行气管切 mL 对黏液高分泌症状的抑制作用和机制。 开及插管，O．5 PBS灌洗肺脏2次并回收；将回收 1．材料和方法 液以1500rpm离心lOmin，收集上清液并保存于一 1．1材料鸡卵蛋白(ovalbumin，OVA)系美国20℃待测。②检测：取上清液0．1mL包被酶标板， Sigma公司产品。TRlwlreagent试剂购自GIBCO公4。C下过夜；反应孔中加入含l％小牛血清白蛋白的 司。1一TaqDNA多聚酶购自日本Takara公司。Re-PBS—Tween20，室温下封闭lh，洗涤；加入1．400稀 vertAidTM逆转录试剂盒为立陶宛Fermentas公司产 品。SB203580购自美国Promega公司。MUC5AC小下孵育lh，洗涤；加人1：1000稀释的辣根过氧化物 鼠抗单克隆抗体购自美国SantaCruz公司。 h，洗涤；加入底 酶标记羊抗鼠IgGlOOtLL，37℃孵育l 1．2方法 min后停止反应。于492 物溶液lOOttL，37。C显色15 1．2．1动物分组及哮喘模型的建立雄性BALB／cnm处测吸光度值(OD值)作为MUCSAC含量的半定 小鼠40只，体重(25-t-3)g，由第四军医大学实验动物量值。预设空白孔和阴性对照孑L。 1．2．4 mRNA 中心提供。采用随机数字表法，将小鼠分为4组，每