hAFP及hTERT双启动子调控的针对人IGF-H基因的siRNA特异性抑制人肝癌细胞生长.pdfVIP

· 1422 · 主国痘理生理 盍 !!』 of th叩hysi0l0gy2013，29(8)：1422．1427 [文章编号] 1000-4718(2013)08—1422．06 hAFP及 hTERT双启动子调控的针对人 IGF．H基因的 siRNA特异性抑制人肝癌细胞生长 汤绍辉 ， 吴胜兰。， 王旷靖 ， 张良鹏 ， 罗羽宏 ， 曹明溶 ， 周鸿科 (暨南大学附属第一医院 消化科，普通外科，广东广州510632) [摘 要] 目的：设计并筛选高效沉默胰岛素样生长因子 II(IGF-H)基因的小干扰 RNA(siRNA)序列 ，构建 由重组人甲胎蛋白(hAFP)和人端粒酶逆转录酶(hrERr)双启动子调控的该 siRNA表达载体 ，观察其对肝癌细胞 生长的影响。方法：根据siRNA设计原则，参照IGF．IImRNA序列设计3对siRNA序列及 1对阴性对照序列，转染 人肝癌Huh7细胞，转染24h后采用实时荧光定量PCR检测IGF-IImRNA表达量变化，筛选干扰效率最高的siRNA 序列。采用 PCR扩增出hAFP及hTERT启动子的核心序列，应用基因重组技术构建重组 hAFP和hTERT双启动子 调控的该 siRNA表达载体。将上述siRNA表达载体转染Huh7细胞及 L-02人正常肝细胞 ，观察IGF．IImRNA表达 及细胞生长情况变化。结果：实时荧光定量 PCR显示，siRNA3在25nmoL／L浓度时抑制效率最高，约90％。成功 扩增hAFP及hTERT启动子核心序列，将其分别克隆入 pGL3一Basic载体 ，构建成重组pGL3h·AFP-hTERT载体 ；将 siRNA3克隆至pGL3．hAFP-hTERT载体，构建成重组pGL3-M ^弛R siRNA3表达载体。Huh7细胞IGF-IImR． NA表达量显著降低，抑制效率达86％，细胞增殖受到明显抑制，G。期细胞比例显著增加 ；L-02细胞上述指标无明 显改变。结论：成功构建双重RNA聚合酶II启动子(hAFP及hTERT双启动子)调控的针对IGF-H基因的siRNA 表达载体，即pGI_3-hAFP-hTERT-siRNA3；该siRNA表达载体可特异性抑制IGF—IImRNA表达及肝癌细胞生长。 [关键词] hAFP／hTERT双启动子；RNA干扰 ；人胰岛素样生长因子II；癌 ，肝细胞 [中图分类号] R735 [文献标志码] A doi：10．3969／j．issn．1000-4718．2013．08．014 HumanIGF--H siRNA drivenbyhAFP／hTERTdualpromotersspecifical- lysuppressesgrowthofhmu anhepatocellularcarcinomacells TANGShao-hui，WUSheng-lan，WANGKuang-jing，ZHANGLiang—peng，LUOYu- hong2 CAO Ming—rong2 ZHOU Hong-ke ， ， (DepartmentofGastroenterology，DepartmentofGeneralSurgery，theFirstAffiliatedHospital，JinanUniverstiy，Guang- zhou510632，China．E-mail：yuhongu／o123@163．corn) [ABSTRACT] AIM：TodesignandscreenthemosteffectivesiRNAtargetinghumaninsulin—likegrowthfactorII (IGF-H)gene，toconstructna siRNAexpressionvectordrivenbyhAFP (humanalpha-fetoprotein)／hTERT(humna te- lomerasereversetranscriptase)dualpromoters，andt