pRluc—hKOR—pcDNA3．1真核重组质粒的构建及在HEK293细胞中的表达.pdfVIP

· 2078· 中国病理生理杂志 ChineseJournalofPathophysiology 2009，25(10)：2078—2080 [文章编号] 1000—4718(2009)10—2078—03 pRluc—hKOR—pcDNA3．1真核重组质粒的构建及 在 HEK293细胞 中的表达 木 李雅林 ， 白 波 ， 陈 京 ， 刘有旺 ， 刘海青 ， 路 海 (泰山医学院，山东 泰安271000；山东农业大学，山东 泰安271018；济宁医学院，山东 济宁272000) [摘 要] 目的：构建与海肾荧光素酶(renillaluciferase，Rluc)融合的人 K型阿片受体 (kappaopioidreceptor， KOR)的真核表达载体，用于生物发光共振能量转移法检测人KOR与其它受体间的相互作用。方法：以质粒pcD． NA3．1一hKOR为模板，PCR方法扩增人KOR。扩增的人KOR用NotI和XhoI双酶切，同时用这2种酶双酶切质 粒pRluc—pcDNA3．1。然后将这2种酶切产物按常规方法连接、转化大肠杆菌ToplO。挑取菌落培养 ，提取质粒， 然后进行酶切鉴定，最后进行测序。将测序正确的重组载体用脂质体法转染人胚胎肾(humanembryonickidney 293，HEK293)细胞，免疫荧光染色 ，共聚焦显微镜观察。结果：扩增出了1条约 1．2kb的片段 ，与预期的人 KOR 大小相符，质粒酶切结果显示重组质粒pRluc—hKOR～pcDNA3．1被切成2条片段，其中1条为pRluc—pcDNA3．1 载体大小，另 1条为 目的片段大小。经测序鉴定，序列与GenBank(NM_0(0)912)中的序列高度同源。共聚焦显微 镜观察显示，阿片受体主要表达在细胞膜上。结论：构建成功了pRluc—hKOR—pcDNA3．1重组真核表达载体，此 表达载体可用于检测人 KOR与其它受体之间的相互作用。 [关键词] 受体，阿片样，K；重组真核表达载体；HEK293细胞 [KEYWORDS] Receptors，opioid，kappa；Recombinanteukaryoticexpressionvector；HEK293ceHs [中图分类号] R331 [文献标识码] A G一蛋白偶联受体 (G—proteincoupledreceptors，GPCRs) 含人 K型阿片受体全长 cDNA基 因序列的重组载体 是最大的细胞膜受体家族，GPCRs参与调节多种病理生理过 pcDNA3．1一hKOR和含Rluc编码序列的重组载体pRlue— 程，在信号识别和转导中具有重要作用…。近年来大量研究 pcDNA3．1(N端)由陈京博士惠赠 (英国UniversityofWar- 表明，G蛋白偶联受体之间存在相互作用，导致对其功能的调 wick)。分子生物学操作所用工具酶购自TaKaRa，质粒提取 节 。阿片受体属于GPCRs，主要包括 K-,和63种受体亚 试剂盒、胶回收试剂盒 、PCR产物纯化试剂盒购 自Pmmega。 型。阿片肽及其受体在痛觉感知、激素分泌和成瘾中发挥广 琼脂糖购自Bioasia生物技术公司，MEM购 自Gibco，转染试 泛的作用。最近的研究资料表明，阿片受体还介导心肌缺血 剂Lipofetamine2000及Opti—MEMI无血清培养基购 自In． 预适应，减轻缺血及 (或)再灌注损伤，减少心肌梗死面积和 vitrogen，多聚赖氨酸购 自Sigma，引物 由上海生工生物工程技 心律失常发生率等，发挥心肌保护作用 。研究发现 ，阿片 术服务有限公司合成。HEK293细胞购 自中国协和医科大学 受体 自身及与其它 GPCRs之间存在相互作用，在转染的系 细胞中心(北京)。兔抗K阿片受体多抗购 自Abeam，罗丹明 统，阿片受体表现出与趋化因子和大麻素受体的二聚化，结 标记山羊抗兔 IsG购 自中杉金桥公司(北京)。 果引起不同类型的受体的交互作用 (crosstalk)。近年来越来 2 方法 越多的报道表明，阿片和生长抑素之间有相互关系 』。为 2．1 引物设计 分别根据pcDNA3．1一hKOR和pRluc— 了对人 KOR受体与其它受体如人 Apelin受体间的相互作用 pcDNA31(N端)的序列特点设计