ELISA操作标准化要点探讨.pdfVIP

首届中国SPF禽类实验动物与兽用生物制品产业论坛 加热直至全部溶解。 3试剂的检查与准备 阴阳性对照血清中会有少量絮状沉淀，其为正常的蛋白析出物，对实验结果无影响。检测前 应确定检测数量，明确使用板孔数，同时准备相应的预稀释板。试剂盒不用的部分应放回冰箱 冷藏。仔细检查试剂盒内各个组分是否变质，如通过颜色进行判断，阴阳性对照血清为均质透 亮或有少量絮状沉淀，阴性对照血清为蓝色，阳性对照血清为黄色，底物溶解液为无色等。如发 现颜色异常或特殊气味，应查明原因。浓缩的洗涤液需用新鲜的蒸馏水或去离子水按要求稀 释，使用不合格的蒸馏水可能使空白值增高；使用加样槽应定时清洗，推荐使用一次性PE手套 衬在加液槽上进行配液，手套与液体接触的部分应避免与手接触，以防污染试剂。 4样品的准备 体液、组织、分泌物和排泄物等均可作为待检样品，但常用的是血清或血浆。血样要求新鲜、 无溶血、无沉淀、均匀。血浆样品要使用含有抗凝剂的采血管采血，颠倒混匀放置一段时间后， 有样品尽量避免溶血，严重溶血和高血脂的样品弃之不用。待检样品宜在新鲜时检测，若需5d 内检测，可使用冰箱2-8℃保存，超过一周时间测定，应于一20℃低温冻存。反复冻溶会使抗体效 价跌落，所以测抗体的血清标本如需做多次检测，宜少量分装冻存。 5样品的处理 酶联免疫反应是一种敏感性很高的反应，如果血清不稀释，不可避免会产生很强的非特异 性反应，出现假阳性。因此，国外检测血清抗体的试剂盒，均规定将血清稀释至适当的倍数，以 降低非特异性反应，使特异性的抗原抗体反应充分体现出来。高倍稀释样本宜分2—3步完成， 如法国LSI的PRRS诊断试剂盒，样品要进行200倍稀释，推荐使用以下步骤：在预稀释板中先 加入95pl的样本稀释液，再加入5斗l的样本，混匀；吸取5山已经稀释了20倍的液体加入 ALV—Ag(p27)诊断试剂盒，推荐使用以下步骤：在预稀释板中先加入245m的样本稀释液，再 的样本稀释液。 应注意吸头不能伸入液面太多，一般对于用移液器取0．1一10斗l容量液体，吸头进入液面下 成样品稀释倍数不准确，检测结果不可信。 6样品和试剂的混匀 稀释前、后的样品必须充分混匀，试剂盒内的所有试剂在加样前也需摇匀，以保证试验的均 一性。不同批号的试剂避免混用，尤其是酶标二抗，否则会引起染色的过深或过浅。 首届中国SPF禽类实验动物与兽用生物制品产业论坛 7样品的加入 稀释板和包被板的样品排布应一致，以免错加、漏加液体。不同的加液步骤其加液顺序要保 证一致，以保证反应时间的统一。推荐使用单道移液器进行样品的第一步预稀释，使用多道移 液器在包被板上完成二次稀释，以缩短样品之间反应时间的差异。加样前应使溶液充分混匀， 并将液体加在孔底，避免加在孔壁上部，尤其是酶标二抗，不要留在孔壁上；避免样品溅出，注 意不可出现气泡。建议在加样完毕后目测包被板孔是否有漏加现象。加样后将包被板及时放人 温箱中进行孵育。 一次实验的标本量过多，加样时间太长，导致先加入的实际反应时间延长，应合理安排实 验，避免几块包被板同时加样，同一块包被板加各种液体的顺序应一致，以取得良好的重复性。 8包被板的孵育 抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为孵育。为使温度快速达 到平衡，建议使用恒温水浴箱；包被板不可重叠放置，以免传热不均匀；注意培养箱温度，放入 包被板后尽量减少开启次数以免影响温度恒定。不能人为缩短或延长孵育时间，孵育时间的一 致是保证准确分析实验数据的重要基础。 9包被板的洗涤 洗涤包被板在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。ELSIA实验 就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。使用8道或12道微量移液器，采用 倒吸的方法进行洗涤；不同厂家的洗液不宜相互混用。洗板时需保证包被板平放，将洗涤液注 满各孔，但尽量避免漏液溢液，以每孔300-350斗1为宜；洗板次数一般为3次，要保证洗板的浸 泡时间，每次设计浸泡时间一般为30～60s；尽量减少洗液残留量，推荐每次洗板后进行拍板，并 及时更换吸水纸，尤其是拍过酶标记物的吸水纸一定要弃去，否则可能造成包被板背景深，阴阳 性对照OD值超出规定范围；吸水纸应选择干净、无或少尘的吸水材料；洗涤如不彻底，特别是 在最后一次，如有酶结合物的非特异性吸附，将使空白孔值升高。 10OD值的读取 滴加终止液后应及时读数，一般在10min内读取的数据比较可靠。确定酶标仪中的滤光片 与实验要求的波长严格一致，否则得出错误的数据结果