检测细胞生长刺激--采用SynergyTMHT检测应激细胞中活性氧(ROS)生成.pdfVIP

A p p l i c a t i o n N o t e 细 胞 生 物 学 采用 SynergyTM HT 检测应激细胞中活性氧 (ROS) 生成 －检测细胞生长刺激 Paul Held Ph. D1, and Kheng Newick2 1Senior Scientist, Applications Dept., BioTek Instruments, Inc. 2Graduate Student, Cell and Molecular Biology Program, University of Vermont 关键词：AlphaScreen® ，cAMP 分析，激酶分析 有关对能够刺激或抑制细胞生长的生物学制剂的研究，一直 以来是细胞生物学家最为感兴趣的领域。其中一项是对刺激 细胞中活性氧家族（ROS ）生成的检测。虽然许多方法都可 以用来评估活性氧家族，但是荧光探针的使用已成为目前研 究的首选方法。本文介绍了使用 Synergy ™ HT 检测 DCF 荧光染料，并以此来检测和分析由于细胞生长刺激所引起的 ROS 的产生。 介绍 活性氧（ROS ）用于描述来源于分子氧的活性分子和自由基 的数目。原本认为活性氧家族只在吞噬细胞进行宿主防御时 才被释放。近期的研究表明，活性氧在细胞信号转导中起到 一定作用，包括细胞凋亡、基因表达、以及细胞信号级联反 应的激活 1。虽然关于活性氧的具体作用目前还知之甚少， 但是其物理性质使之成为细胞第二信使理想的候选物。ROS 分子很小，消失前只在很小的范围内发生弥散。此外，还有 多种调控机制与 ROS 的降解有关。 同时，一些酶也被认为 能够产生活性氧基团，NADPH 氧化酶是最有代表性的酶 1。 图 1. NADPH 氧化酶的激活。 NADPH 氧化酶的激活受到复杂系统的调控，其中涉及 G 蛋 白 Rac2 。在休眠细胞中，膜包裹的异源二聚体多肽 (p22-phox 材料和方法 和 gp91-phox) 含有血红素基团和 FAD 基团，可以在 NADPH 原发性间皮瘤细胞在含有 10％ FCS 的 DMEM 培养液中进行 氧化酶未激活的情况下，使来自细胞质的 NADPH 电子经过 培养。细胞经胰蛋白酶消化后计数，并用新鲜的培养基悬浮， 细胞膜到达分子氧 1。普遍认为，当 gp91-phox 多肽作为一个 浓度为 30,000 个 /mL 。使用 MicroFlo 蠕动泵分液器 (BioTek) ， 质子泵时会发生电荷补偿。在受到刺激时，一些多肽 ( p47- 将细胞接种到 Corning24 孔板 ( 货号 :3337) ，37°C 培养。第 phox, p67-phox 和 p40phox ) 转运至细胞膜的内表面，形成 二天，改为无血清培养基，并将细胞放置在培养箱中孵育过夜。 一个充分活跃的具有 NADPH 氧化酶活性的酶复合物（图 1 ）。 细胞和染料在含有 5μM H2DCFDA-AM 的新鲜 DMEM 培养 活化复合物中含有 G 蛋白 Rac ，刺激后从 GDI 解离，与 GTP 液 ( 不含酚红 ) 中 37°C 孵育 30min ，CO2 浓度为 5%。随后 结合并与膜联合 2 。聚集的复合物随后催化氧和氢离子形成过 用新鲜的培养基洗涤细胞两次，将没有发生特异性结合的染 氧化氢（图 1 ）。 料去除。清洗后，将含有实验条件所需物质的培养基加入， 用动力学法检测荧光信号。使用 Synergy HT 微孔板检测仪 DCF 反应 (BioTek) 在 37℃下进行检测。检测采用 485/20nm 的激发滤 为了观察活