基础生物.学实验六实验手册.docVIP

襄樊学院 化学工程与食品科学学院生物系 基础生物学实验六实验手册 目录 一、植物DNA的提取 2 二、琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段 4 三、聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA片段 6 四、DNA片段回收及与载体连接 8 五、大肠杆菌感受态细胞制备与转化 10 六、碱裂解法小量提取质粒及质粒酶切 12 七、细胞特异性染色 15 八、动物细胞的基本形态观察和细胞计数 19 九、细胞凝集反应和细胞膜通透性的观察 23 十、线粒体和液泡的超活染色与观察 26 十一、聚乙二醇（PEG）介导的细胞融合 28 十二、细胞骨架系统的显示与观察 30 十三、植物细胞的有丝分裂染色体标本制片及观察 33 十四、蚕豆根尖微核检测技术 36 一、植物DNA的提取 【目的要求】 学习提取和纯化高等植物总DNA的方法，理解其原理。 【基本原理】 通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。  十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。 【实验用品】 1、实验材料 幼嫩叶子 2、器材 移液器，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵， 1.5ml离心管，。 3、药品 2% CTAB抽提缓冲溶液: CTAB 4g NaCl 16.364 g 1M Tris-HCl 20ml( PH8.0) 0.5M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌, 冷却后0.2-1% 2-巯基乙醇 （400ul） 3、24：1/氯仿:异戊醇 4、 RnaseA母液 5、其它试剂：异丙醇、TE缓冲液，无水乙醇、70%乙醇。 【方法步骤】 1、取冷冻保存或新鲜的植物材料，液氮下研磨，然后转移到液氮预冷的1.5ml离心管中，加入500μl DNA提取缓冲液，65℃水浴1hr‘每隔15min上下颠倒一次； 2、从水浴中取出后，冷却至室温，加入500μl 24：1 氯仿：异戊醇，上下轻柔颠倒混匀； 3、12,500rpm离心5分钟，取上清，加入500μl 24：1 氯仿：异戊醇，上下轻柔颠倒混匀； 4、如果中间层蛋白质过多，重复步骤2； 5、12,500rpm离心5分钟，取上清，加入2.5倍体积的无水乙醇，冰箱冷藏沉淀30分钟； 6、12,500rpm离心5分钟，弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀，12,500rpm收集沉淀； 7、干燥沉淀，用50μl 含有RnaseA的TE溶解沉淀； 【实验结果】 【实验报告】 二、琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段1 【目的要求】 学习水平式琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的方法和技术 【基本原理】 琼脂糖凝胶电泳技术是DNA 分子片段的分子量测定和分子构象研究以及DNA 分离纯化的重要实验手段。DNA 分子在琼脂糖凝胶电泳中泳动时受到电场驱动力和凝胶的摩擦阻力。一般情况下，单位长度双链DNA 带有几乎相等的电荷，故在一定电场强度下，DNA 分子的迁移速度取决于凝胶的摩擦阻力，即DNA 分子本身的大小和构型。DNA 分子的迁移速度与相对分子量的对数值成反比关系，具有不同长度的DNA 片段由于其泳动速度不同而得到分离。具有相同一级结构但构型不同的DNA 分子也可以通过这种方法进行分离。溴化乙锭(EB)是一种荧光染料，在紫外光照射下可发出波长590nm 的红色荧光，DNA 分子与EB 形成荧光络合物后，其发射的荧光比原来要增强数十倍，常用来观察凝胶中DNA 条带的位置。 【实验用品】 1、实验材料 上次实验提取的DNA 2、器材 刻度量筒、玻璃棒、三角烧瓶、移液枪及枪头、微波炉或沸水浴、凝胶灌制平板(塑料或玻璃制成)、凝胶样品梳、稳压稳流电泳仪、凝胶成像系统、电源等。 3、药品 琼脂糖凝胶(0.7～1.5%，琼脂糖粉末与1×TAE 配成)，TAE(Tris-乙酸盐，EDTA)电泳缓冲液[50×浓缩贮存液：Tris 碱242g；冰醋酸57.1mL；0.5 mol/L EDTA (pH8.0)，100mL；加600mL、蒸馏水，剧烈搅拌，加蒸