引经药牛膝促进骨髓干细胞定向归巢治疗股骨头坏死实验研究.pdfVIP

引经药牛膝促进骨髓干细胞定向归巢治疗 股骨头坏死的实验研究 1 2 1 2 2 1* 2 孔祥英 , 王荣田 , 田能 , 李莉 , 孔焕宇 ，林娜 , 陈卫衡 ( 1 中国中医科学院中药研究所，北京 100700；2 中国中医科学院望京医院，北京 100102) [摘要] 目的：观察活骨Ⅱ方配伍引经药牛膝后对液氮冷冻性股骨头坏死兔骨髓干细胞归巢至股骨头 的影响，探讨其防治股骨头坏死的作用机制。方法：36 只兔经液氮冷冻法建立股骨头坏死模型后，随机分 为模型、活骨Ⅱ方及活骨Ⅱ方+牛膝三组，另 12 只设为伪手术组。在造模同时所有动物均皮下注射 rhG-CSF （30μg/kg·d，连续 7 天），并分别灌胃生理盐水和相应中药。于注射rhG-CSF 前后进行外周血 WBC 计数。 分别于给药 2w 和 4w 后取材：检测血清中骨钙素（BGP ）和骨形态发生蛋白（BMP2 ）水平，双侧股骨头 HE 染色观察组织病理学改变、原位杂交法检测 BMP2 mRNA 水平及免疫组织化学法测定 BrdU 及 SDF-1 的表达。结果：与伪手术组相比，模型组空骨陷窝率、血清 BGP 、股骨头 SDF-1 水平显著升高，血清及股 骨头 BMP2 水平明显降低。与模型组相比，活骨Ⅱ方及活骨Ⅱ+牛膝组股骨头空骨陷窝率显著降低，血清 BGP 和 BMP2 、股骨头BMP2 mRNA 、BrdU 及 SDF-1 的表达均明显升高，其中活骨Ⅱ方+牛膝组上述变化 趋势更显著，2w 时仅活骨Ⅱ方+牛膝组 BrdU 计数显著升高，而且 2w 时BGP 和 SDF-1，4w 时空骨陷窝率 和血清 BMP2 水平显著高于活骨Ⅱ组。结论：引经药牛膝能在一定程度上提高活骨Ⅱ方防治实验性股骨头 坏死的疗效，其机制可能与牛膝的骨髓干细胞定向归巢促进作用有关。 [关键词] 股骨头坏死；骨髓干细胞；归巢；引经； 股骨头坏死的临床疗效至今仍不令人满意。利用内源性骨髓干细胞（Bone marrow stem [1] cells，BMSCs ）对损伤组织进行修复是近年干细胞应用领域的新探索 。既往研究表明内源 性BMSCs可以被病灶的炎症刺激作用“召唤”而归巢到局部，但其作用极为有限[2] 。研发促进 干细胞归巢于病变组织的药物或方法，近年备受关注。 活骨Ⅱ方是我们在临床治疗股骨头坏死常用的经验方[3-5]，应用中常根据病情在此基础 方中加入不同作用引经药以提高临床疗效。鉴于“引经”药具有明显的作用趋向、可引导它药 作用于病变部位的特性，究竟加入引经药与BMSCs归巢有无关系？本研究拟采用液氮冷冻 股骨头坏死模型，应用粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF ） 将BMSCs动员到外周血，以观察活骨Ⅱ方加入引经药牛膝后对动员起来的BMSCs归巢到股 骨头坏死部位的影响。 1 材料与方法 1.1 实验动物 健康成年日本大耳白兔 48 只，雄性，体重 2.2～2.8kg 。由北京梅里亚维通实验动物技 术有限公司提供，合格证号：SYXK1100-0022。自由进食、饮水，饲养在二级实验动物中心， 室温 20 ℃-25℃，明暗光照 12h: 12h。 1.2 实验药品和试剂 活骨Ⅱ方（由北黄芪、当归、赤芍、川芎、地龙、桂枝等组成）和牛膝用水煎煮制成 含生药 1g /ml 的溶液备用，由中国中医科学院中药研究所提供；重组人粒细胞集落刺激因 子（rhG-CSF ），山东格兰百克生物有限公司，批号。5- 溴-2- 脱氧尿苷 (5-Bromo-2’-deoxyuridine, BrdU)，美国 sigma 公司；小鼠抗兔 BrdU 抗体，zymed 公司； 骨 钙素（Bone Gla protein, BGP ）放射免疫试剂盒：解放军总医院科技开发中心放免所，批号： 。骨形成蛋白 (Bone morphogenetic protein ，BMP)-2 ELISA 试剂盒 USNlife 公司）， 批号。 BMP-2 原位杂交试剂盒，武汉博士