肠道微生态变化与移植肝CGD的相关研究.pdf

中文摘要 我国是乙型病毒性肝炎高发地区，由于缺乏高效抗乙型肝炎病毒药物，使肝 硬化、慢性重型肝炎及肝癌等终末期肝病患者的数量居高不下。终末期肝病患者 的治疗最终依赖于肝移植术。近年来，肝移植手术在我国取得了长足的发展。目 前，肝移植手术1年生存率在80％以上，5年生存率大于70％，移植效果接近 于国际先进水平，此得益于精湛的手术及免疫抑制剂的广泛使用。但肝移植后的 各种并发症如急、慢性排异、胆道并发症、细菌及病毒感染等阻碍了受体存活率 及移植肝存活率的进一步提高。 不同于健康人，免疫抑制剂的使用使肝移植患者的免疫处于抑制状态，这是 肝移植后肝炎病毒及肿瘤复发的主要原因，也是细菌、病毒感染的主要原因。为 道屏障功能的损伤。Gabe等的临床研究发现，FK506可抑制肠上皮细胞的能量 产生，损害肠道的吸收功能，增加肠道通透性，引起内毒素血症。给肝移植术后 早期患者服用微生态制剂(合生元)则可显著降低其术后早期感染的发生率，并 可缩短抗生素的使用时间。上述这些研究结果提示在肝移植患者，免疫抑制剂、 肠道微生态及细菌感染三者之间存在着有机的联系，但这些动物及临床研究均没 有检测肠道细菌生态的变化情况。 本研究采用分子生物学定性、定量技术，分析肝移植患者肠道主要菌群的生 态结构变化，同时采用偶氮显色法、酶标法及放射免疫法检测内毒素、与内毒素 相关的肿瘤坏死因子、IL一6及肠道分泌性免疫球蛋白A(sIgA)等免疫指标的 变化，研究免疫抑制刹对肝移植患者肠道微生态的影响及肠道微生态变化与其全 身及肠道局部免疫功能的关系。 材料与方法 1、研究对象 1．1健康志愿者共28例，男性25例，女性3例，年龄22—57岁，平均37．6 ±8．2岁。 1．2肝硬化患者共51例，分别为浙江大学医学院附属第一医院的住院或门 诊病人，其中男性45例，女性6例．年龄28—63岁，平均45．5±9．9岁。本组 患者作为肝移植术后患者的对照组，除1例外，其余50例均未行肝移植， 1．3肝移植术后患者共lll例，其中男性99例，女性12例，年龄22—64 岁，平均42．6±9．2。所有的肝移植术后患者服用免疫抑制剂，主要方案有： CsA+MMF、FK506+MMF、FK506等。 l-4接受肝移植术中细菌易位研究的肝硬化(部分并发肝癌)患者78例， 男性70例，女性8例{最小年龄26岁，最大年龄62岁：平均年龄47．5±8．9 岁。 2、研究标本 2．1新鲜粪便、血液、肠系膜淋巴结 3、研究方法 3．1厌氧菌(双歧杆菌)冻千保存技术： 3．2粪便基因组DNA抽提方法的建立及优化； 3．3含肠道目标细菌特异16srDNA基因片断的质粒DNA构建、克隆建 库及测序： 3．4荧光定量PCR定性、定量分析粪便目的细菌群； 3．5放射免疫方法检测粪便分泌型免疫球蛋白A； 3．6鲎试剂偶氮显色检测血内毒素； 3，7ELlsA法检测受试者血液TNFa及IL一6： 3．8血液及肠系膜淋巴结的厌氧培养 3．9SPSSfor forwindows8，2)用 windows(vcrsion11．5)，SAS mrsion 于临床资料及检测数据的统计分祈 结 果 1_建立了双歧杆菌冻干保存方法，经过12个月的4℃保藏，本研究所得的冻干 双歧杆菌菌粉活菌数在107一108cFu／g菌粉，存活率在88％一99％之间。 2．QIAG刚试剂盒结合玻璃珠击打方法的细菌裂解效率最好，获得吣A纯度最高 是适合于高质量抽提人粪便细菌DNA的方法。 2 3．78例接受肝移植患者有8例发生了细菌易位，发生率为10．396(8／78)：细菌 易位的部位以MLN为主，占62．5％(5／8)，发生BT的细菌主要是肠道革兰阴性 兼性厌氧杆菌(占55．6％，5／9)，其次为革兰阳性兼性厌氧球菌(占22．2％，2／9)。 4．细菌易位组患者术煎总胆红素显著高于无细菌易位组(P=O。022)；发生缨菌 易位的患者其术后感染的风险是无细菌易位的患者的l