沙冬青低温胁迫全长cDNA文库构建及AmDHN和AmRD22基因的克隆.pdfVIP

摘 要 沙冬青是我国西北荒漠区唯一的常绿阔叶灌木，具有很强的抗寒和抗旱等抗逆 特性。为了发掘其抗寒基因并探讨其抗寒性分子机理，本论文以蒙古沙冬青 （Ammopiptanthus mongolicus ）为材料，用SMART技术构建了其在低温胁迫下的全 长cDNA文库，对文库中的部分克隆进行了5’端测序和序列分析，并在此基础上克隆 了两个抗逆相关基因的cDNA 。主要研究结果如下： 6 1.所构建的原始文库滴度为9.44×10 pfu/mL ，重组率为98.3% ；扩增文库滴度为 1.98×1010pfu/mL ；插入片段长度在0.5~2.5Kb ，多数接近或超过1kb。这些结果表明 文库的质量较高。 2.利用PCR方法从文库中挑选出3000个阳性克隆，将其中480个克隆进行5’端测 序，得到438条有效EST序列，经拼接获得46个Contig和302个Singlet ，合计348个 Unigene 。 3.将Unigene进行blastx 比对，有215条可被已知或推测功能的同源基因所注释， 其中包括冷诱导蛋白、脱水素、类甜蛋白、防御素、金属硫蛋白、蛋白酶抑制剂、 ABA诱导蛋白和转录因子等逆境应答相关蛋白的编码基因。功能未知的新基因有 133个。 4. 以文库中获得的脱水素基因（AmDHN ）全长cDNA序列为基础，用PCR方法 扩增到其完整编码框cDNA片段，并将其构建到植物表达载体p3301上，然后用农杆 菌介导法转化野生型拟南芥，目前已获得T2代转基因植株。 5. 以本实验室在前期研究中获得的AmRD22 基因部分序列为基础，通过RACE技 术获得该基因的全长cDNA序列（由1196bp组成），然后用PCR方法从文库中扩增到 其完整编码框cDNA片段（由1083bp组成），并构建了其植物表达载体 p3301-35S-AmRD22 。 本论文所构建的cDNA文库和获得的Unigene序列为今后开展表达谱分析、筛选 和鉴定蒙古沙冬青抗寒基因提供了平台，对AmDHN 和AmRD22 基因所做的工作为进 一步分析其功能奠定了基础。 关键词：沙冬青；低温胁迫；cDNA文库；AmDHN 和AmRD22 基因克隆 Construction of full-length cDNA library of Ammopiptanthus mongolicus under low temperature and cloning of AmDNH and AmRD22 Abstract As an only evergreen broad-leaf shrub in the northwest desert of China, Ammopiptanthus mongolicus shows very strong resistance to cold and drought . In order to explore the chilling-resistant genes and to analyze the chilling -resistant mechanism of the plant, a full-length cDNA library under low temperature stress was constructed by using SMART(switching mechanism at 5’-end of RNA transcript) cDNA library construction method, and some clones of the libarary were sequenced from their 5’ ends and the seqnences were analyzed. On the bases, two genes related to stress-tolerance were cloned. The main results are as follows: 6 1. The titer of the unampli