酵母提取物诱导欧洲花楸悬浮细胞合成次生代谢产物的机制探究.docVIP

酵母提取物诱导欧洲花楸悬浮细胞合成次生代谢产物的机制探究 　　[摘要] 以欧洲花楸悬浮培养细胞（SASC）为材料，检测酵母提取物（YE）处理后SASC生理生化指标的变化，初步探究YE诱导SASC合成次生代谢产物的机制。结果表明： YE诱导SASC合成了5种联苯类化合物，且5种化合物含量随诱导时间的延长呈现不同的变化规律；YE处理抑制细胞的生长；细胞培养液中的pH随着处理时间的延长逐渐降低；细胞中的可溶性蛋白质含量表现为缓慢下降的变化趋势，YE处理组（YE组）可溶性蛋白质含量与对照组（CK组）相比显著增加，最高时相对增量达到了147.76%；CK组和YE组细胞外Ca2+都表现为内流，但YE组的内流明显小于CK组。 说明YE诱导使细胞处于一种胁迫状态，不利于细胞的生长，迫使细胞合成了联苯类化合物抵御外界胁迫；细胞内可溶性蛋白可能作为酶类参与调控化合物的合成；Ca2+信号分子可能介导细胞应对YE胁迫的信号转导。 　　[关键词] 欧洲花楸悬浮细胞；酵母提取物；次生代谢产物；机制 　　[收稿日期] 2013-12-20 　　[基金项目] 国家自然科学基金项目81072989）； 国家科技支撑计划项目（2012BAI29B02，2012BAI28B002） 　　[通信作者] 郭兰萍，Tel：（010）E-mail： glp01@126. com 　　[作者简介] 黄蕾，E-mail： hnlei-27@163.com 　　欧洲花楸Sorbus aucuparia L.为蔷薇科苹果亚科花楸属落叶乔木或小乔木，原产欧洲和亚洲西部温带高山区域[1]，其干燥成熟果实可食用和入药[2]。我国花楸属植物50余种，资源丰富，供药用者约6种[2]。目前研究发现，苹果亚科植物受到外界病原菌侵害时特异性地产生联苯类化合物作为植保素[3]，Kokubun T等使用铜离子处理欧洲花楸叶片后，可以从叶片中分离出欧花楸素[4]，这种联苯类化合物在健康的植株中并不存在，且其具有广泛的生物活性。欧洲花楸是集药用、食用、园林和生态价值于一身的珍贵树种。 　　欧洲花楸悬浮细胞（SASC）生长速度快、周期短，可作为很好的研究材料[5]，已有研究发现用酵母提取物（YE）作为诱导子处理可使SASC迅速合成联苯类化合物[6]。但是，目前这类具有植保素作用的化合物合成机制尚不明确，还有待进一步的研究。 　　本实验以SASC为材料，通过检测YE处理后SASC次生代谢产物的变化及其细胞培养液中pH、可溶性蛋白含量、细胞外Ca2+流等生理生化指标的变化，初步探究YE诱导SASC合成次生代谢产物的机制，尤其是从可溶性蛋白和钙离子2个方面为机制研究提供了很好的思路和方向，为更深层次地研究打下基础。 　　1 材料 　　欧洲花楸悬浮细胞系由中国科学院植物研究所叶和春研究员赠送。 　　培养箱（Conviron Adaptis CMP6010）；超大型摇床（ZYSA0351）；电子天平（Sartorius BS 2202S）；超净工作台（SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台）；分析型酸度计（JENWAY3510）；高效液相仪（Waters 2695_2996）；UV检测器（T6新世纪19-1650-01-1169）；液质联用仪（Agilent 6320 Ion Trap）；其他常规设备。 　　牛血清蛋白为美国MP公司产品；Yeast extract为OXOID公司产品；其他试剂均为国药集团化学试剂有限公司产品。 　　2 方法 　　2.1 细胞悬浮培养体系的建立 诱导出的欧洲花楸愈伤组织接种于含50 mL MS固体培养基的400 mL广口瓶中，愈伤组织每 14 d 继代1次，经过3～5次继代后，选择疏松的愈伤组织转入液体培养基中培养，每 250 mL 三角瓶中分装 50 mL 的液体培养基，置于25 ℃培养箱中暗培养。悬浮细胞培养转速设定为 120 r?min-1。实验中使用的欧洲花楸悬浮细胞是将减压过滤后的 1.4 g细胞接种于含有 20 mL MS液体培养基的100 mL 三角瓶中。 　　2.2 YE诱导子的配制及处理 用蒸馏水溶解酵母提取物，配制60 g?L-1的母液，高压灭菌。参照Liu B等处理方法[6]，处理终浓度为3 g?L-1。 　　2.3 欧洲花楸悬浮细胞中次生代谢产物的提取和检测 将收获的细胞用15 mL甲醇在研钵中研碎，使用滤纸和漏斗将滤液过滤到鸡心瓶中，过滤后的细胞残渣再用10 mL甲醇提取1次，合并滤液，将鸡心瓶置于旋转蒸发仪上浓缩至干。培养基用15 mL乙酸乙酯萃取2次，用分液漏斗分离，将乙酸乙酯层倒入提取细胞后的鸡心瓶中，置于旋转蒸发仪上浓缩至干。用1 mL的乙酸乙酯定容。 　　将提取液中的乙酸乙