苦碟子注射液对缺血性脑卒中火毒证大鼠作用的差异蛋白质研究.docVIP

苦碟子注射液对缺血性脑卒中火毒证大鼠作用的差异蛋白质研究 　　[收稿日期] 2014-01-09 　　[基金项目] 国家重点基础研究发展计划（973）项目（2012CB518406）；北京中医药大学创新团队发展计划（2011-CXTD-23） 　　[通信作者] *张允岭，教授，主任医师，博士生导师，从事中医药防治中风和老年期痴呆临床及机制研究，Tel：（010E-mail：yunlingzhang2004@163.com 　　[作者简介] 王凤丽，在站博士后，从事中医脑病专业，E-mail：wfl2773@126.com 　　[摘要] 探讨中药苦碟子注射液对缺血性脑卒中火毒证大鼠脑组织蛋白质表达的调控作用。采用角叉菜胶复合大脑中动脉阻塞（MCAO）方法制备缺血性脑卒中火毒证大鼠模型，按随机数字表法将SD大鼠分为药物组、模型组和假手术组。采用TTC染色法和HE染色法对脑组织进行大体观察和病理形态学观察；利用双向凝胶电泳技术寻找缺血性脑卒中火毒证大鼠和假手术大鼠之间与疾病相关的差异表达蛋白，并观察应用苦碟子注射液连续干预72 h后，对差异蛋白表达水平的影响。结果显示，缺血性脑卒中火毒证大鼠与假手术大鼠间有差异表达蛋白，连续给予具有清热解毒通络作用的苦碟子注射液能够减轻脑组织缺血形态学改变，调节部分差异蛋白表达水平。 　　[关键词] 苦碟子注射液；缺血性脑卒中；火毒证；电泳；蛋白质组 　　脑卒中是一组突然起病，以局灶性神经功能缺失为共同特征的急性脑血管疾病，又称为中风或脑血管意外，具有高发病率、高病死率、高致残率等特点[1]。世界卫生组织调查结果显示[2]：中国脑卒中发病率排名世界第一，比美国高出1倍。我国第3次国民死因调查结果也表明[2]，脑卒中已经升为中国第1位死因。其中以急性缺血性脑卒中最为多见，占全部脑卒中的60%～80%[3]，严重危害着国民健康和生命。本研究采用中药苦碟子注射液对缺血性脑卒中火毒证大鼠进行干预，并运用蛋白质组学方法，从整体蛋白质分子水平探讨苦碟子注射液对脑组织蛋白表达的影响，寻找可能的治疗靶点。 　　1 材料 　　1.1 动物 　　健康雄性SD大鼠36只，体重240～260 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号SCXK（京）2012-0001。 　　1.2 药物与试剂 　　苦碟子注射液由通化华夏药业有限责任公司生产，批准文号国药准字角叉菜胶（Carageenan， c1013）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）均为Sigma公司产品；蛋白Marker（SM1811）购自加拿大Fermentas公司；24 cm固相pH梯度（IPG）胶条（pH 3～10，NL）、硫脲、矿物油均为美国GE Amersham Biosciences产品；Bio-Lyte 3/10 Ampholyte为美国Bio-Rad公司产品；Protease Inhibitor、苯甲基磺酸氟（PMSF）、溴酚蓝、3-[3-（胆酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸内盐（CHAPS）、乙二胺四乙酸（EDTA）、考马斯亮蓝G-250（CCB G-250）、二硫苏糖醇（DTT）、低熔点琼脂糖、甘氨酸（Glycin）、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸氨、N，N，N′，N′-四甲基二乙胺（TEMED）、尿素、十二烷基磺酸钠（SDS）、碘乙酰胺、甘油、2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）均为Amresco公司产品；其余药品均为国产分析纯试剂。 　　1.3 仪器 　　ELx800通用酶标仪（美国BioTek公司），VCX130PB超声波破碎仪（美国Sonics公司），CP100WX高速冷冻离心机（日本日立公司），ULT-1386-3V超低温冰箱（美国Thermo Scientific Revco公司），EttanIPGphorⅡSystem，Ettan Daltsix Electrophoresis System及EPS601 Power Supply（美国GE Healthcare公司），PowerLook 2100xl扫描仪（台湾UMAX公司），ASP300全封闭组织脱水机（德国LEICA），EG1150组织包埋机（德国LEICA），RM2265全自动半薄轮转切片机（德国LEICA）。 　　2 方法 　　2.1 动物分组 　　随机分为模型组、药物组、假手术组，每组各12只（课题组在前期工作中，已有研究结果表明[4]，苦碟子注射液能够降低神经功能损伤评分，减轻脑组织缺血形态学改变，且中药组苦碟子注射液对神经损伤的改善作用强于西药组盐酸法舒地尔注射。而本研究旨在寻找苦碟子注射液发挥脑保护作用的蛋白靶点，因此未设药物对照组）。模型组和药物组按照下述的角叉菜胶复合大脑中动脉阻塞（MCA