水飞蓟发状根培养体系的建立及其水飞蓟宾含量的测定.docVIP

水飞蓟发状根培养体系的建立及其水飞蓟宾含量的测定 　　[摘要] 实验采用6种发根农杆菌R1601，R15834，R1000，A4，R1025，R1感染水飞蓟植体，诱导水飞蓟发状根及其水飞蓟宾的产生。6种发根农杆菌均能诱导水飞蓟产生发状根， A4表现出较强的对水飞蓟的感染能力。实验通过侵染时间、预培养、共培养、pH等因素确定了诱导水飞蓟发状根产生的条件，确定MS液体培养基适合水飞蓟发状根的增殖。经过PCR分子鉴定，发根农杆菌中的DNA质粒成功的整合到转化根的基因组中。使用液相色谱测定了水飞蓟发状根中水飞蓟宾含量是水飞蓟植物中的2.5倍。实验所建立的水飞蓟发状根培养系统，为研究水飞蓟发状根大量培养生产水飞蓟宾奠定了基础。 　　[关键词] 水飞蓟；发根农杆菌；发状根；水飞蓟宾 　　[收稿日期] 2013-11-13 　　[通信作者] 杨世海， Tel：（0431） E-mail：jlyangs@163.com 　　[作者简介] 张淑丽，硕士研究生，E-mail：littlepighappy@ 　　水飞蓟Silybum marianum （L.） Gaertn别名水飞雉、乳蓟、老鼠筋、如蓟子，原产于南欧及北非，属于菊科水飞蓟属植物，干燥成熟的果实入药。瘦果呈长倒卵形或椭圆形，长5～7 mm，宽2～3 mm。表面淡灰棕色至黑褐色，光滑，有细纵花纹；顶端钝圆，稍宽，有一圆环；中间具点状花柱残迹；基部略窄，质坚硬。破开后可见子叶2片，浅黄白色，富油性，气微，味淡[1]。水飞蓟种子和水飞蓟植物中含有水飞蓟素，水飞蓟素具有抗肝中毒、保护肝细胞膜、改善肝功能的药理活性，临床用于治疗肝炎、胆囊炎等[2]，主要成分为水飞蓟宾。近年来水飞蓟素又扩展应用到抗衰老和美容化妆品领域[3]；随着研究的深入，水飞蓟素在癌症的治疗中也发挥着越来越重要的作用[4-5]，市场需求巨大。 　　利用发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes诱导药用植物产生发状根，寻求建立适合生产次生代谢产物的培养系统，已成为药用植物培养系统的一个研究热点。与传统的细胞培养技术相比，发状根具有遗传稳定、生长迅速、合成次生代谢物质能力强且稳定及向培养液释放部分代谢产物等优点，是生产次生代谢产物较理想的组织[6]。 　　本研究利用发根农杆菌R1601，R15834，R1000，A4，R1025，R1诱导水飞蓟组织产生发状根，建立水飞蓟发状根离体生长的培养体系，为发酵法扩大培养提供可行性动力学参数，同时也为药用植物水飞蓟提供一条可持续性利用的新途径。 　　1 材料与方法 　　1.1 水飞蓟无菌苗的培养 　　供试水飞蓟S. marianum种子采自吉林农业大学药植园，经吉林农业大学中药材学院杨世海教授鉴定。挑选当年成熟干燥的水飞蓟种子，温水浸泡60 min后，在生物洁净工作台内用无菌水清洗3次；75%乙醇浸泡30 s，无菌水清洗3遍，每次清洗30 s；然后再用0.1% HgCl2浸泡10 min ，无菌水再次清洗5～6次，每次清洗2～3 min。最后用灭菌滤纸将种子表面的水分吸干，用镊子轻轻放置在装有MS固体培养基（不添加任何激素）中，置于温度为24～25 ℃、光强2 000 lx、光照12 h?d-1、黑暗12 h?d-1的条件下交替培养，等待萌发无菌水飞蓟幼苗，作为遗传转化用的外植体。 　　1.2 发根农杆菌的活化 　　发根农杆菌菌株Agrobacterium rhizogenes R1601，R15834，R1000，A4，R1025，R1，由中国农业微生物研究所菌种保藏中心提供。在无菌条件下，用接种针挑取保存菌液，于YEB 固体平板上划线培养，放置于28 ℃暗培养条件下培养，直到长出单菌落。挑取1个单克隆菌落接种于装有加有Kan的20 mL YEB液体培养基中，28 ℃恒温摇床，180 r?min-1条件下培养24 h，将农杆菌复苏。将已复苏的菌液取出1 mL加入装有50 mL YEB液体培养基的锥形瓶中，恒温摇床28 ℃，180 r?min-1再次培养12 h，A600为0.4时进行侵染。 　　1.3 水飞蓟发状根的诱导 　　在无菌条件下将水飞蓟无菌苗的幼嫩叶片剪成0.5 cm2大小的片段，根、茎段、叶片分别剪成长约0.5 cm和0.5 cm2的小段和叶片。每个样品在MS0（不添加任何激素）固体培养基上接种10片（段），并且每个样品均做3次平行，黑暗中26 ℃下预培养36 h。在超净工作台内，将预培养的外植体（根段、茎段、叶片）转移至活化好的发根农杆菌菌液中，侵染。在侵染过程中，轻轻地摇晃锥形瓶，4 min后用无菌滤纸吸干表面菌液，接种到固体培养基上，在24 ℃黑暗条件下共培养12 h，转接到含有500 mg?L-1 Ce