西农萨能羊脂肪酸合酶基因乙酰%2f丙二酸单酰基转移酶区域重组腺病毒载体的构建.pdfVIP

218 中国草食动物 20lO年专辑 西农萨能羊脂肪酸合酶基因乙酰／丙二酸单酰基转移酶 区域重组腺病毒载体的构建 朱江江，罗 军，赵旺生，王伟，石恒波，李君 (西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌712100) 摘 要：研究旨在通过构建西农萨能羊脂肪酸合酶(FAS)基因乙酰／丙二酸单酰基转移酶(MAT)区域的重 组腺病毒栽体。为下一步其在奶山羊乳腺上皮细胞中过表达。进一步研究MAT的功能和作用机制做准 pAdTrack／CMV上并线性化后．转化含有腺病毒骨架载体pAdEasyl的E．coliBj5183感受态细胞进行同 源重组，并用PacI酶切鉴定。提取质粒后转化E．coliTopl0进行扩繁。将本次克隆的MAT序列与 GeneBank收录的序列相比对。在60lbp处．碱基由G转变为A，导致氨基酸序列由Ala201转变为 ，11lr20l。经鉴定并测序分析。试验成功构建MAT基因的重组腺病毒表达栽体，可用于下一步病毒包装。 关键词：脂肪酸合酶；乙酰／丙二酸单酰基转移酶；腺病毒栽体 研究表明，羊乳的营养价值与其短、中链脂肪酸的 含量较高紧密相关。反刍动物臌S基因的MAT区域1．2样品采集 不仅具有转移酶活性．而且具有终止脂肪酸延长而形 以西北农林科技大学萨能羊原种场健康的纯种西 成中链脂肪酸的硫酯酶活性。泌乳期反刍动物MAT农萨能羊(1．5岁，头胎，泌乳天数28d)为试验材料，手 能够终止碳链的延伸而特异性的生成并释放短、中链 术法采集乳腺腺泡组织样品。早晨常规屠宰后，立即采 脂肪酸，由此可以推断山羊MAT基因对山羊乳短、中 集2g左右乳腺组织，用DEPC水洗净样品表面残留的 链脂肪酸的合成起重要调控作用。因此。MAT基因功 血液及杂质。迅速投入液氮中保存用于总RNA提取。 能的系统性研究对从分子的角度提高羊奶的营养价值 1．3 S 利用Trizol一步法提取西农萨能奶山羊乳腺组织 具有重要意义。VangipuramRangan等(1996)克隆了 总RNA．并用1％的琼脂糖凝胶电泳初步检测RNA完 鼠FAS的MAT区域基因，并在大肠杆菌中表达，得到 了具有催化活性的蛋白。说明MAT能够在体外单独 整性。一80℃长期保存。第一链eDNA的合成按照 折叠为有活性的蛋白质。本研究在克隆西农萨能羊 Takara公司第一链eDNA合成试剂盒说明书操作。 MA 1．4西农萨能羊MAT基因的克隆 T基因的基础上。利用AdEasy系统构建该基因的 重组腺病毒表达载体．为下一步进行腺病毒的包装并 1．4．1 在山羊乳腺上皮细胞中进行过表达。从而进一步研究 MAT的功能做准备。 1材料与方法 成)，并在上游加上勋nI酶切位点和起始密码子；下 1．1材料 切位点。序列为： 腺病毒穿梭载体pAdTraek／CMV、腺病毒骨架载体 pAdEasyl及E．coliBj5183菌种均由清华大学常志杰 教授惠赠；pGM-T C’I’cTL3’； Vector、14连接酶购自美国Promega 公司；B型小量质粒快速提取试剂盒购自北京博大泰 TGCAGCCCG，兀℃IGGG7兀．-3’。 克公司。大肠杆菌Topl0、Markerlll、高纯度质粒小提中 量试剂盒购自北京天根公司：大量琼脂糖凝胶DNA回 1．4．2 目的基因的克隆和鉴定设计退火温度为64℃． 收试剂盒、LA DNA聚合酶及限制性内切酶EcoR Taq 20斗L体系进行PCR扩增，回收