醋酸棉酚对小鼠黄体细胞凋亡的影响.pdfVIP

中国畜牧兽医学会家畜内科学分会 中国·南昌 第七届代表大会暨学术研讨会论文集 死精、少精和无精子症，在临床上主要用于男性避孕药。近年来，棉酚作为一种新型的抗肿 瘤药物对多种肿瘤都有明显的增殖抑制作用，如前列腺癌、结肠癌、膀胱癌、乳腺癌、胶质 瘤、子宫肌瘤、肺癌、肝癌、喉癌、头颈部肿瘤等，其中以前列腺癌的研究最为广泛111。棉 酚的雄性抗生育作用早已被证实，而棉酚对雌性繁殖毒性作用的研究较少。有报道，妊娠母 猪饲喂低酚棉饼对胚胎发育无不良影响，且有利于20H龄以内的吮乳仔猪的生长发育和提高 成活率12J。但有动物实验结果表明，棉酚抑制卵泡发育和成熟，使窦状卵泡减少，闭锁卵泡 增加，血浆雌二醇降低13J。大剂量棉酚能扰乱雌性哺乳动物的动情周期，阻止受精卵发育、 降低着床率14]。杨波等的研究也表明，醋酸棉酚对离体大鼠黄体细胞有直接杀伤作用，并影 响其孕酮合成15]。因此为了探讨棉酚对母畜的繁殖毒性作用，合理开发利用棉籽饼粕作为畜 禽配合饲料，进行了本试验研究。 1材料与方法 1．1实验动物与试验设计 25一30日龄96只昆明系雌性小鼠由湖南中医学院小动物室提供，动物室自然节律采光， 室温18,-V22℃，湿度45～65％，清洁，安静，试验用醋酸棉酚用10％乙醇配制。预饲7d后 称重，随机分为5组，分别为空白对照组(A组)，乙醇对照组(B组)，醋酸棉酚染毒低剂 量(C组)、中剂量组(D组)、高剂量组(E组)，每组16只。皮下注射PMSG10IU，48h 后，另外皮下注射HCG10IU，促使小鼠形成黄体。48h后分别腹腔注射醋酸棉酚，再于24h 和48h分别取出8只毒素组小鼠称重，摘眼球取血后断颈椎处死，取出黄体化卵巢。试验设 计见表1。 表1试验设计 Table1 ofTest Designment 1．2主要试剂 醋酸棉酚(价购于原浙江轻工业学院)；注射用血促性素(PMSG)(宁波市激素制品有限 公司)；注射用绒促性素(HCG)(宁波市第二激素厂)；丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成 生物有限公司)iSOD试剂盒(南京建成生物有限公司)；TRIzol总RNA提取试剂盒 BIOTECH CO．，L1’)；Tunel试剂盒f武汉博士德生 (invitrogen)：RT-PCR试剂盒(TIANGEN 物工程有限公司)；孕激素放射免疫试剂盒(北京市福瑞生物工程公司)：其余试剂均为国产分 析纯，购自上海化学试剂公司。 1．3卵巢黄体的病理学切片 将卵巢置于10％的中型福尔马林溶液中固定24h后，常规石蜡包埋，4|Im切片，50C 烘烤4h后，HE染色并于光镜下进行组织学观察。 1．4SOD活性，MDA含量以及血液中孕激素含量的测定 将卵巢黄体细胞按试剂盒说明操作，检测其MDA含量和SOD活性，孕激素的检测采 用放射免疫法。将得到的各组数据用DPSv3．01软件处理，进行方差分析：所有数据均以均 中国畜牧兽医学会家畜内科学分会 中国·南昌 第七届代表大会暨学术研讨会论文集 值±标准差(X±s)表示。 1．5细胞凋亡检测 TIJNEL法检测黄体细胞的凋亡，切片常规脱蜡入水，然后按试剂盒说明操作，DAB显 色，苏木素复染，中性树胶封片。光学显微镜观察，细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞， 即凋亡细胞。观察并计算黄体细胞的凋亡率，每张切片任意取10个高倍镜视野(400X)， 计数总黄体细胞中阳性(凋亡)细胞数目，计算阳性细胞率．结果采用统计软件DPSv3．01处 理，进行方差分析；所有数据均以均值±标准差(X±s)表示 1．6 RT-PCR法检测小鼠黄体BCM。Bax和P53基因的表达 小鼠卵巢黄体．70C低温冰霜保存，按照试剂说明书进行操作、检测。看家基因[3-actin 在动物体内表达稳定，外界的变化一般不会改变它的表达水平，我们以[}-actin基因作为内 Labworks