中药芪卫颗粒对自发性2型糖尿病KK-Ay小鼠肾小管上皮细胞转分化的影响.pdfVIP

第～篇 实验研究 8 cDNA 第一链合成试剂盒(CW0744)及UltraSYBRMixture(withRox)(CW0956)均购自北京康 为世纪生物科技有限公司。 1．3引物序列由上海英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。引物序列见表1 表1荧光定量PcR引物序列及引物间片段长度 1．4仪器WL9一ONETOUCHUltra稳豪血糖仪(美国强生)；GD8一DCA2000+糖化血红蛋白／ 尿微量白蛋白分析仪(德国拜耳)；7160全自动生化分析仪(日本日立)；奔腾删X多媒体微 ABI)。 2．方法 2．1动物模型的建立与分组C57BL／6J小鼠喂以普通饲料(12％脂肪，60％碳水化合物，2876 蛋白质)，l(1【一Ay小鼠饲高脂饲料(58…．肪，25．6％碳水化合物，16．4％蛋白质)，自由摄食、 饮水，适应性喂养4周。小鼠12周龄时，将C57BL／6J小鼠作为正常对照组，将随机血糖 ≥16．7mmol／L的KK—Ay小鼠随机分为：模型组、中药组(芪卫颗粒组)、两药组(缬沙坦组)。 2．2给药芪卫颗粒组按生药209·kg～·d 1灌胃， 1灌胃，缬沙坦组予缬沙坦lOmg·kg～·d 模型组与正常组予等体积蒸馏水灌胃。定期测体重与血糖，连续处理16周。 2．3观察指标及检测方法 2．3．1生化检测 28周龄时处死实验各组小鼠。处死前，禁食水24小时，剪尾用葡萄糖氧化酶法测定血 糖水平；提尾反射法搜集小鼠随机尿用免疫比浊法和Benedict-Behre法检测尿微量自蛋白／ 尿肌酐(albumin-creatinine ration，ACR)：10％水合氯醛麻醉下腹主动脉取血致死，免疫 乳胶凝集抑制法检测全血糖化血红蛋白，分离曲．清用全自动生化分析仪测定血尿素氮、血肌 酐水平。内生肌酐清除率(ml·min—I)=尿肌酐(1a mol／L)X24h尿量(m1)／(血肌酐(II mol／L)×1440(min)×体重(kg) 2．3．2肾脏病理检查 小鼠处死后立即摘取左侧肾脏，剥去包膜，10％中性福尔马林闹定，石蜡包埋，制成2 um连续切片，经HE、PAS雨lMasson染色后，在中国重光6500i光学显微镜下观察肾组织的病 理形态学改变。， 双盲给予HE染色下肾问质损伤病变计分，小管间质损害的特征按Banff分级捂’进行0～3+ 半定量计分：无变化评0分；轻度改变评1分(病变范同25％)；中度评2分(病变范围26％，-- 50％)：严重评3分(病变范闱50％)。记录连续不重叠的15个200倍视野的数值，取其平均值 来比较每例切片的肾小管间质区域病变的释度。 2．3．3免疫组化 石蜡包埋的4u 47 1) 首都医科大学中医药研究生论坛(201 DAB显色，脱水，透明封固。结果判断：PBS替代一抗作为阴性对照。以胞浆内出现棕黄色 或黄色颗粒为阳性结果，表示有标记蛋白的表达。根据肾小管上皮细胞的染色范围判断阳性 表达强度。IHC半定量结果评定：根据染色程度和范围进行分析评定。每例切片200倍下观 察20个互补重叠肾间质视野，根据染色程度和着色范围旧1进行分析评定(见表2)。将每张 切片的染色程度和范围得分相乘即为其最后得分。分别由两名医师双盲进行积分，取其平均 值。 表2IHC着色程度及范围评分 2．3．4荧光定量PCR 超纯RNA提取试剂盒提取肾组织总RNA。用HiFi—MMLVcDNA第一链合成试剂盒将mRNA Mixture(2×)10u 逆转录为cDNA。配置RT反应体系：加入UltraSYBR 1，上下游引物各 0．4u u l，cDNA模板21，