转化蘡薁(Vitis+thunbergii+Sieb.et+Zucc.)PGIP提高了烟草病原相关酶的活性.pdfVIP

Sieb．et 野生葡萄夔奠(HasthunbergiiZucc)。产于中国华北、华中、华南各省以及朝鲜、日本 等地，木质藤本，属于东亚种群，与欧洲种群葡萄相比，对真菌病害自腐病、炭疽病和黑痘病抗性 更强，是丰产、抗病育种中的主要资源(贺普超，1999)。因此，我们从婴萸中克隆了PGIP基因， 并构建了superl300％刚埝俨双元表达载体，烟草是一种转基因研究的模式植物，转化体系成熟， 易于获得阳性植株，本实验通过农杆菌介导法转化烟草植物，拟验证其在植物抗病中的作用，将对 植物分子抗病育种工作具有重要意义。 l材料和方法 1．1实验材料 烟草(Nicotiana benthamiana‘K326’)的组培苗由本实验室保存。 购自Promega公司，引物由上海英骏生物技术有限公司合成，用于酶活性检测的各种化学试剂， 均采用进口与国产AR级。 保存，40％甘油．70℃保存。 1．2含有PGIP目的基因的植物双元表达载体的构建 I和Sal I双酶切，分别回收、纯化目的基因小片段和表达载体大片段。将回收后的两片段用T4DNA连接 酶16℃过夜连接。将连接好的表达载体转化大肠杆菌DH5a扩大培养，提取质粒，并进行PCR、 酶切和测序鉴定。 1．3烟草叶盘法遗传转化 利用农杆菌介导的遗传方法转化烟草，待抗性芽长至3-5cm时，剪下，转入生根培养基中诱导 生根。转基因植株的炼苗移栽：生根后打开瓶盖， 进行自然光照，温度控制在20．25℃，炼苗3d。 再将转基因苗移栽至营养钵中，保湿，待成活后置于室外自然条件下培养。 1．4烟草株系PCR扩增检测 对照及潮霉素阳性烟草转基因植株基因组DNA和RNA的提取参照的常规CTAB法。’目的基 以P35-GCTGl]隗TGCGGCCAll’GTC．3’和P4 等；2008)进行基因组PCR和转录组RT-PCR的验证。 1．5拷贝数检测 采用一种基于PCR技术鉴定单拷贝转基因烟草的简单有效方法(宋锋eta1．，20／0)。两条目的条 带的灰度比，当转基冈烟草植株中外源基因与内源基因的扩增条带灰度比为l时，所检测植株即为 单拷贝外源基因的转基因烟草植株。 1．6转基因烟草中各种保护酶表达量的测定 重要的防御酶(张树生等：2006)，参与活性氧清除及酚类、木质素和植保素等抗病相关物质的合 成，能抵御活性氧及氧自由基对细胞膜系统的伤害，增强植物对病害的抵抗能力。丙二醛OVIDA)是细胞 膜脂过氧化作用的产物之一(Smimo最1995)，其产生数量的多少能够代表膜脂过氧化的程度，也 可间接反映植物组织的抗病能力的强弱。近年来，人们对多种植物感病后某些酶活性的变化规律进 行深入研究，发现其活性与植物抗病有关(张树生等；2006；苗则彦等；2003)。 对照株系和转基因株系割伤处理6个小时后，取样部位为植株从上向下第4片完全展开叶进行 试验。测定防御酶的具体方法如下：利用愈创木酚法(罗红艺等，2004)测定过氧化物酶(POD) PAL活性测定依据(薛麻龙等，】983)方法。 以上所有数据均I睨3淡以上亚复测定的平均值，ⅢExcel作圈。 2结果与分析 2I 含有PGIP目的基因的植物双元表达载体的构建 S1300’表 达栽体分*UⅢXba 1年¨Sa／I取酶切。分*Uj唧收小片段和大片段(圈1)，将同收后的两片段用T4 之后测序验讪：，结粜表明杜J建的表达载体是正确的．可以进行r一步的转化基因的研究。 o多f、毫 ～嚣／ 7葛 ……～Fwm㈨= 。＼ ／》， ＼ 矿。。。j曼． =0-—， …1＼～… ／ 篇 ＼ ／ ““