动物细胞同工酶检测方法的改良及其应用.pdfVIP

ChinMed 中国医药生物技术2007年2月第2卷第1期 Biotechnol，February2007，V01．2，No．1 ·技术革新· 动物细胞同工酶检测方法的改良及其应用 李岑，张国荣 同工酶是一类催化功能相同但化学组成和结 构不同的酶，广泛地存在于高等生物细胞内。不同 5 3 0．2 10 mg，NADmg，NBTmg，PMSmg，MgCl 种属来源的细胞具有不同的同工酶分布，通过电泳 8．O)2ml，加去离子水 mg，0．2mol／L的Tris—C1(pH 分离可得到它们特异性的同工酶图谱，因此同工酶 定容至10蚰。 检测可作为种属鉴别的依据。这项技术广泛地应用 (6)NP显色底物：肌苷20 mo儿的 mg，0．1 2ml，NBT3 0．2 于生物学研究的各个领域【1。J。目前，国内常用的同 Nail2P04 mg，PMSmg，黄嘌呤 工酶检测方法大多存在着制胶麻烦、上样量大、电 氧化酶12．8肛l，加去离子水定容至10蚰。 泳时间长、所需染色液量大且灵敏度差等缺点。而 美国Innovative公司的AuthentiKit(TM)系统，虽 Eppendorf公司。 然操作方便，灵敏度高，但价格过于昂贵。我们选 1．2同工酶检测方法的改良 1．2．1 用乳酸脱氢酶(LD)、苹果酸脱氢酶(MD)、葡萄 细胞酶液抽提在相关文献[1，5]基础上，我 糖一6一磷酸脱氢酶(G6PD)和核苷酸磷酸脱氢酶 们改进如下，将检测细胞在T-25培养瓶中培养，当 (NP)等4种同工酶为分析对象，并且参照国外生长至铺满瓶底时，吸出培养基。加1ml胰酶置 AuthentiKit(TM)系统，对同工酶检测方法尤其是37℃温箱消化2～5min，使细胞脱壁。加2IId含 细胞酶液抽提、凝胶制备及电泳等多个环节进行了 10％小牛血清的MEM培养基或1滴小牛血清中和 优化和改良，取得了较好的效果。 胰酶的作用，并将其转移至1．5IIll无菌离心管(EP ml 管)，于1000r／min离心5min，弃去上清。加1 1材料与方法 的PBS液吹打均匀，1000r／min离心5min，弃去 1．1 材料 上清。估算细胞的体积，加等体积的细胞裂解液放 1．1．1 min，4。C、3000 min， 细胞系6个种属的动物细胞L929(小鼠)、置冰上裂解30 r／min离心5 HeLa(人)、MDCK(狗)、PKl5(猪)、CHO(中吸出上清移至新的EP管，于_20℃保存。用分光光 国仓鼠)和HBZY-1(大鼠)细胞系均由武汉大学度计(A562)测定细胞抽提物的总蛋白浓度 中国典型培养物保藏中心提供。