骨髓培养及染色体标本制备操作流程.docVIP

骨髓培养及染色体标本制备 细胞培养： 准备1 个培养瓶，加入10.0ml Irvine Scientific公司的陈氏培养基BMC 2. 样品加入前，37预温。 3． 加入0.5ml(500μl)的骨髓样品。如果外周血中白细胞30000ⅹ109个/毫升， 加入少量的样品。如果外周血中白细胞5000ⅹ109个/毫升，加入较多的样品。 4． 摇匀，放入二氧化培养箱孵育1-2天。 收获试管： 用无菌移液管（不要倒）把培养瓶中的培养液转移至15 ml的离心管中 然后每个离心管中加入80μl（0.08ml）脱碳秋水仙碱（10μg/ml）。盖上盖，轻轻的多次颠倒直到样品混合均匀。 放入37.0℃孵育箱20分钟。 转速1200，离心 8分钟。吸去上清液 用手指拨动试管底部以混匀沉积细胞。把试管放在涡旋器上，速度设定在慢档，很慢的加入10ml0.075M KCL低渗液。 室温静置20分钟（低渗处理），离心8分钟 去除上清液，留下大约1ml的低渗液和沉积细胞。注意有时纤维性的物质经过离心与细胞一起混合沉积，部分浮在上清液里，用离心机抽吸最后几毫升的上清液时，容易把纤维性的物质和细胞一起抽吸掉。为防止这种情况发生，可用巴士德吸管人工吸掉上清液。 用手指拨动试管底部以混匀沉积细胞。把试管放在涡旋器上，速度设定在慢档，很慢地加入10ml 3：1甲醇：乙酸的固定液。 室温静置15分钟（第一次） 转速1200，离心 8分钟。 去上清液，混合沉积细胞，象前一次一样加入固定液5ml。（第二次） 转速1200，离心 8分钟。 去上清液，混合沉积细胞，象前一次一样加入固定液5ml。（第三次） 转速1200，离心 8分钟。 制片： 离心5 ml的细胞悬液，去上清液 在少量固定液中混匀细胞。具体的量决定于细胞的多少。制片前，把预处理的玻片用超净水冲洗后，并浸没。 用干净的镊子，把玻片从水中取出，用吸水纸吸取多余的水份，留下薄薄一层水膜。擦去玻片反面的水珠，立即开始滴片。 用巴士德吸管混匀细胞悬液。吸取少量的细胞悬液（够滴一张片子）。不要把细胞悬液吸上太多，以防细胞黏附在吸管，导致细胞丢失。 用以下的两种方法滴片 以30o 角度竖起玻片，吸管距离玻片0 - 3cm，滴 1-2 滴的细胞悬液在近毛玻片处， 让细胞悬液向下流，用吸水纸吸去多余的水。 平放玻片，吸管距离玻片0 - 3cm， ，滴 1滴的细胞悬液在玻片中央处，用吸水纸在边缘吸去多余的水。用这种方法时，不要滴两滴在玻片上，导致细胞不均匀的干燥。 让细胞悬液均匀的分布到玻片上。干燥时应在1-2分钟。 将片子置于45-60oC 的烤箱中过夜，染色前还需要在90 oC 的烤箱中烤15-30分钟。 染色： （1）放置6个染色缸 #1 (100ml) 98ml生理盐水缓冲液 2ml胰岛素储存液[12.8mg/ml] *****用 0.2M Na2HPO4 调节pH 致 7.0 #2 (100ml) 100ml生理盐水缓冲液(pH 7.0) #3 (100ml) 100ml生理盐水缓冲液(pH 7.0) #4 (50ml) 24ml麦氏染色缓冲液 16ml蒸馏水 14ml磊氏染色储存液[1.6mg/ml] #5 (100ml) 100ml蒸馏水 #6(100ml) 100ml蒸馏水 （2）染色时，把玻片完全浸入染色缸中 缸#1 胰岛素储存液 10-20秒 缸#2 冲洗液 完全浸洗 缸#3冲洗液 完全浸洗 缸#4 染色 2 1/2 -3分钟 缸#5冲洗液 完全浸洗 缸#6冲洗液 完全浸洗 （3）磊氏染色储存液会形成一种发亮的浮在表面的物质，染色前要先用吸水纸吸去。 （4）用吸水纸吸干或空气吹干片子。