_分子生物讲义：第七章 分子生物学常用技术.ppt

分子生物学常用技术 第一节 凝胶电泳 带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳（electrophoresis）。 电泳技术主要用于分离各种有机物（如氨基酸、多肽、蛋白质、酶、脂类、核苷、核苷酸、核酸等）和无机盐，也可用于分析某种物质的纯度及分子量的测定等。 电泳技术在分子生物学领域应用非常广泛，特别是以琼脂糖和聚丙烯酰胺为支持介质的凝胶电泳，以操作简便、快速、灵敏、分离范围广等优点成为分离、纯化、分析和鉴定核酸的主要手段。 一、琼脂糖凝胶电泳 （一）原理 核酸分子是两性解离分子。在pH3.5时，碱基上的氨基基团解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，整个核酸分子带正电荷；在pH 8.0~8.3时，碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电荷。若将由pH8.0电泳缓冲液制成的凝胶置于电场中，核酸分子由于带负电荷会向正极泳动。不同大小和构象的核酸分子由于所受到来自电场的驱动力和来自凝胶分子筛网孔的阻力差异，具有不同的迁移率。 （二）操作要点 1．琼脂糖的选择 琼脂糖是一种从海洋植物琼脂中提取出来的长链状多聚物。一般琼脂糖在溶液中加热到80~900C熔化，形成清亮、透明的液体，浇在模具上冷却后固化形成凝胶，是一种理想的电泳支持物 .不同的琼脂糖产品在纯度、熔解温度以及成胶后的机械强度等特性上有较大差异。使用者可以根据研究需要选择不同类型的产品. （1）低熔点琼脂糖：这类琼脂糖由于在糖链上引入羟乙基，熔点降低，熔化温度 700C，低于双链DNA的变性温度，故利于DNA的回收，但这种凝胶的分辨率及机械强度较差. （2）高纯或超纯琼脂糖：一般琼脂糖中常含有其他多糖、盐及蛋白质等杂质，这些杂质往往会对DNA、RNA片段的酶切、标记或进一步克隆有干扰。另外，高纯度琼脂糖凝胶强度较高，不易破碎. （3）高筛分琼脂糖：一般琼脂糖的孔径较大，对1000bp以下的分子分离效果较差。新近生产的高筛分琼脂糖具有高分辨率及高强度等优点，能区分相差4个碱基的DNA片段，除可用于RCR产物的分析外，还能用于基因分型、四核苷酸重复序列分析等。 2．凝胶浓度的选择 琼脂糖一般用于分离200~50000bp的DNA片段。凝胶浓度不同，分辨DNA大小的范围不同。根据需要分离的核酸分子的大小选择合适的凝胶浓度，即可达到理想的分离效果。 3．DNA分子量标准 通常采用已确定核苷酸序列的噬菌体或质粒DNA，经限制性核酸内切酶完全水解，然后用所获得的特定大小的酶切片段作为DNA凝胶电泳的分子量标准（DNA marker）。 由于线状双链DNA分子泳动距离与分子量的对数成反比，若以已知片段大小的DNA分子的泳动距离为横坐标，分子量为纵坐标，即可绘出可以确定DNA分子量的标准曲线 琼制糖凝胶电泳常用的DNA分子量标准 4．琼脂糖凝胶电泳缓冲液 缓冲液有用于双链DNA电泳，pH为8.0的Tris-乙酸（TAE）、Tris-硼酸（TBE）或Tris-磷酸（TPE）缓冲液，和用于变性单链DNA的碱性电泳缓冲液（pH8.0，含50mmol/L NaOH，1mmol/L EDTA）。 TAE的缓冲能力较差，长时间电泳后会使其缓冲容量消失，使阳极变为碱性，阴极变为酸性，故需及时更换缓冲液。TBE和TPE的缓冲能力较强，可重复使用数次。 碱性缓冲液不能直接用于熔化凝胶，因为NaOH加入热琼脂糖溶液后会引起多糖水解。制胶时应先用蒸馏水溶解琼脂糖，在倒胶前再加入碱性缓冲液。 5．样品制备 琼脂糖凝胶电泳通常是将凝胶板全部浸入电泳缓冲液中，以“潜水电泳”的方式进行。 为了不使样品在电泳槽缓冲液中上漂并指示电泳的距离，常在制备好的DNA样品中加入含有蔗糖或甘油以及指示剂（溴酚蓝、二甲苯青等）的上样缓冲液。 样品中含盐量不能太高，否则电泳中会出现区带消失、前沿不齐等现象。样品中DNA含量以每条区带的DNA不少于0.1μg为宜。DNA浓度亦不能过高，否则会使电泳区带变宽，泳动距离异常。样品的用量由加样孔的体积决定，通常为10~50μl。 6．电泳条件 DNA琼脂糖凝胶电泳通常采用1~2V/cm凝胶（低压电泳）、8~10V/cm（中压电泳）或几十伏以上/cm（高压电泳）的电压降进行恒压电泳。电泳时间可根据指示剂的迁移位置确定。电泳温度以15~25℃为宜。 7．DNA电泳染色 DNA电泳采用荧光染料溴乙锭（EB）染色。溴乙锭能与DNA结合，嵌入配对碱基之间，在紫外光照射下，DNA区带发出红色荧光，根据荧光可以确定DNA在凝胶中的位置。使用时将溴乙锭直接加入凝胶液中，使其终浓度为0.5μg/ml，或于电泳完毕后，将电泳凝胶浸入含0.5μg/ml溴乙锭的溶液中，染色30~45分钟后，即可在紫外灯下观察、拍照。 8．DNA片段的回收 DNA分子经过凝