复合型组织工程化自体皮肤体外快速构建的实验的研究.pdf

◇’囊，怠慧，囊 复合型组织工程TE茸俸废肮率外嶙莲啊琏的霉验研究 复合型组织工程化自体皮肤体外快速构建 的实验研究 研究生：洪清琦 导师：杨斌副教授 中山大学第二附属医院整形外科 摘 要 目的： 寻找一种体外快速构建复合型组织工程化白体皮肤的可行方法，为大面积烧 创伤创面的覆盖快速提供足够的自体皮肤。 方法： 含表皮干细胞的表皮细胞群的分离(--种分离方法的比较)：分别应用I型 胶原酶法、胰蛋白酶法及中性蛋白酶法，进行人皮肤组织表皮细胞群的分离。前 者分离所得的表皮层及后两者分离表皮层后的真皮层，均进行组织学切片，苏木 素一伊红(H—E)染色观察，三者所得表皮细胞群均经流式细胞仪检测其中角蛋白 19(K19)阳性细胞的百分比。含表皮干细胞的表皮细胞群的鉴定及培养：I型胶 原酶法分离的表皮细胞群，分别进行K19异硫氰酸荧光素(FITC)及B1一整合素 质细胞生长因子(KGF)与否对表皮细胞群生长曲线的影响，应用丝裂霉素c处理 后的人成纤维细胞饲养层培养表皮细胞群，观察其体外增殖情况。成纤维细胞的 分离培养及鉴定：I型胶原酶法分离表皮细胞时的消化剩液经过滤离心后，所得 疫荧光鉴定。复合型组织工程化自体皮肤的构建：表皮细胞群以i×i05个／cm2 直接接种于脱细胞真皮基质(ADM)的乳头面，约第7天时，翻转ADM再接种已扩 增的成纤维细胞，收集标本进行组织学切片H—E染色，表皮层细胞计数，设培养 基添加KGF组及不添加组。构建皮肤修复裸鼠全层皮肤缺损的初步实验：构建皮 ◇毫。墨荛兰 冠台型组织工程T巴自俸皮肤俸外燠莲相琏的饔验研宅 肤移植于裸鼠背部全层皮肤缺损创面，设三组对照，对照一：裸鼠自体全厚皮片 移植(将背部一～侧取下皮肤移植于另一侧)，对照二：单纯ADM移植，对照三： 裸露创面不做修复。修复后约6周，收集实验组创区皮肤，进行组织学功片H—E 染色，抗人角蛋白10(K10)一FI rc及K19一FITC免疫荧光检测。 结果： 、 】型胶原酶法分离所得的表皮细胞群中K】9阳性表达的细胞最高可接近 1-t 17％，比胰蛋白酶法及中性蛋白酶法高。表皮细胞群中，K19FITC及B 其克隆形成率介于1％8％之间；表皮绌胞单纯体外培养困难，添加K6F后，增殖 较快，且分化有所减缓，但仍渐分化成复层，并脱落；人成纤维细胞饲养层培养 的表皮细胞群，于约第3天时开始出现克隆样增殖，并渐出现复层化，经几次换 液后，复层化细胞脱落，残留细胞丌始呈现单层克隆样增殖，于约14天时渐推 开成纤维细胞，形成融合，但仍无法维持继续传代。I型胶原酶法分离表皮细胞 时，可同期获得成纤维细胞，体外培养扩增较容易，约7天左右即可扩增100 倍，vimentin—FITC免疫荧光染色呈阳性染色。利用先期接种表皮细胞于ADM， 再接种已扩增的成纤维细胞，并应用添加KGF的条件培养基培养，可以快速构建 出超过30倍于原取材面积的皮肤，表皮层连续，细胞层数多为23层，部分分 层较好，表皮层与真皮层之间的粘着均不紧密，真皮中含有成纤维细胞；表皮层 细胞计数显示，KGF添加组细胞计数明显高于未添加组。所构建皮肤能够较好的 修复皮肤缺损创面，创区皮肤表皮层分层好，均有34层细胞覆盖，真皮层胶原 排列有序，成纤维细胞分布均匀，未见皮肤附属器，与裸鼠自体全厚皮片移植修 复后的皮肤组织结构基本接近；抗人KIO FITC免疫荧光显示创区表皮层，绝大 部分细胞早绿色的阳性染色，抗人K19-FITC免疫荧光显示仅有极个别基底层细 胞呈绿色的阳性染色。 结论： 利用胶原酶消化法，以及涿加KGF的条件培养基，采用分步接种法，町以在 体外短期内(约8天)构建出足够可用(约30倍于取栩面积)的复合型组织工 程化自体皮肤，这可能为临床上严重烧创伤创面的覆盖解决了皮源问题。 关键词：表皮干细胞；角质细胞生长因子；组织工程；皮肤，自体：