长角血蜱唾液腺中microRNA表达吸血关系研究.pdfVIP

论文集 家畜寄生女学分会第十二次学术研讨会 ★通讯作者：李国清，教授：E—mail：gqli@scau．edu．C11 长角血蜱唾液腺中microRNA表达与吸血关系的研究 龚海燕，张厚双，周勇志，曹杰，周金林+ (中国农业科学院上海兽医研究所，农业部动物寄生虫学重点开放实验室，上海200241) 关蛋白质的调控机理的探索提供基础数据。解剖未吸血和半饱血长角血蜱成蜱的唾液腺，提取总RNA 归类与表达风度分析。结果发现，未吸血蜱唾液腺中表达的保守miRNAs家族有769个，而半饱血蜱中 血过程中几乎消失，可能对靶基因的抑制解除，从而引起靶蛋白的大量表达，这为蜱吸血过程中蛋白 的调控机理的研究提供了重要信息。 关键词：镰形扇头蜱；长角血蜱；唾液腺；miRNA 蜱作为人在内的哺乳动物、鸟类、两栖动物乃至爬行类等多种宿主的外部寄生虫，不仅吸血造成 宿主的失血消瘦、神经麻痹和炎症等症状，而且其作为传播媒介，传播多种病毒、细菌、支原体以及 体内寄生虫。2010年河南省对蜱叮咬造成死亡事件的报道再一次唤醒了大家对蜱的危害性的认识。蜱 的防控重新成为关注的焦点。目前的防控理念是化学防治、遗传防治、免疫预防和生物防治等。但是 化学药物毒性大，残留时间长’，还可能引起蜱的抗性。疫苗BM86的商业化是抗蜱疫苗研制中成功的一 例，但是BM86只对一种蜱(微小牛蟀)效果显著。对于其他已经发现的800多种蜱的效果还不能确定。 遗传防治和生物防治的研究现在还处于探索阶段。让人感兴趣的是，蜱的种类虽然多样，但是都必须 通过吸血产卵这一生命过程。因此了解与吸血密切相关的蜱唾液腺中蛋白分子的调控机制(现在还不 得而知)对抗蜱制剂或疫苗的研发具有重要意义。miRNAs研究的兴起可能为解释这一机制提供了新的 途径。 研究表明miRNAs与癌症形成，免疫调节以及病原入侵直接或间接相关。在昆虫中，对果蝇和蚊子的m iRNAs的研究处于领先地位，这些研究表明miRNAs与激素产生，器官发育及产卵过程存在密切关系。 等研究者早期就发现蜱的唾液腺在吸血过程中显著增大而细胞数量并未增加，蛋白总量比吸血前增加 25倍，其中的调节机制尚不清楚。因此对蜱唾液腺中miRNAs与蛋白的关系进行研究很可能为我们提供 答案。之所以专注于蜱的唾液腺miRNAs的研究，还有一个原因是唾液腺不仅是蜱完成吸血的重要器官， 也是蜱将蛋白和蜱传病病原输入宿主的窗口，因此唾液腺可能是我们对蜱吸血和病原进行拦截的最直 接切入点。本研究通过高通量测序了解吸血前后长角血蜱成蜱唾液腺的miRNAs数据，分析上调或者下 传播的研究奠定了基础。 —．142- 家畜寄生虫学分全第十二次学术研讨会 回固E 1材料与方法 1．1材料 长角血蜱采自上海野生动物园，在中国农业科学院上海兽医研究所的实验室于25度92％湿度条件下 保存并在新西兰大白兔耳上吸血，完成增殖。 1．2方法 1．2．1样品的收集和总RNA的抽提为了获得半饱血蜱的唾液腺，将成蜱接种于兔耳吸血4天后取下，并立 即在显微镜下解剖唾液腺。用同样方法获得未吸血蜱唾液腺并保存于PBS，．80℃保存。根据说明书，用 (Eppendorf)检测总RNA的浓度。 1．2．2d、RNA的纯化和高通量测序10u 回收后，再于Solex澳4序仪(华大基因公司)上进行高通量测序。 1．2．3序列分析和保守同源序列的鉴定因所测序列包括接头序列和其它非编码RNAs，因此对所得序列 比对，组装和差异分析等。 miRNA 1．2．4蜱吸血前后miRNAs的差异表达分析miRNA的标准化：Normalizedmi RNAcount／totalcountofclean 000000 reads)木1 变化倍数的计算：Fold．change=l092(Fed／unfed) 后表达显著差异的miRNAs进行搜索和靶基因的预测。 2结果 2．1吸血前后蜱唾液腺miRNAs的测序结果 液腺miRNAs序列。其中37，853条和14，14