免疫实验(中国医科大学临床药学).docVIP

实验安排 实验一、ELISA板包被，封闭；小鼠抗原免疫；补体结合实验 实验二、小鼠脾细胞提取及计数 实验三、流式（测小鼠血T细胞）；NO测定； 双扩；血型鉴定 实验四：ELISA；妊娠反应（试纸法） 包被 、封闭ELISA反应板 微量加样器的使用 包被ELISA 反应板 ，37℃孵育1小时。 封闭ELISA反应板 ，37℃孵育0.5小时。 实验目的：检测小鼠抗绵羊红细胞抗体水平试剂与器材操作方法 注意事项： 挑选干燥、洁净是试管。若有水的试管会导致红细胞不等渗溶血。 水浴箱不可关闭水浴箱的盖子。水浴箱的盖子上的水若调入试管中，会造成反应体系不等渗，进而导致红细胞因为渗透压的差异而破裂溶血。 实验结果：1号管中试剂变澄清，2.3号试管均浑浊 实验三：小鼠脾细胞提取及计数 实验原理：脾脏是人类最大的免疫器官，捕获血源性抗原，储存血液。是动物体内最大的淋巴器官。深居于左侧肋弓之后，颜色暗红、质地柔软、呈内侧向内凹陷的扁椭圆形或条索状等。脾为表面有被膜覆盖的实体性器官。脾细胞主要成分：淋巴细胞，是执行免疫功能的重要细胞。为进一步了解和检测淋巴细胞的数量和功能，还需要制备脾细胞悬液。 实验试剂与器材：SRBC免疫一周的小鼠（眼球取血后的死亡小鼠）； PBS液—作用是等渗、平衡渗透压、维持离子强度和PH； 70%酒精—作用是消毒 红细胞裂解液—2ml冷NHCl 动物解剖器械—平镊和齿镊、5ml注射器、平皿、1.5ml微量离心管、15ml离心管、吸管、盖玻片。离心机，细胞计数板，显微镜 实验步骤： 取脾：将眼球取血后的小鼠颈椎脱位法处死； 70%酒精皮毛全部浸湿3-5分钟，右侧卧位； 左手持镊（尖头）提起皮肤，右手持剪刀于左侧肋骨最低点与髋关节间做一小切口 ；双手持镊子与切口垂直方向钝性分离皮肤，暴露腹膜； 左手持镊提起腹膜右手持剪刀于腹膜做一小切口，双手持镊子与切口垂直方向钝性分离腹膜，充分暴露视野，于左侧肋缘下可见暗红色条索状脾脏； 持【平镊】轻轻夹住脾脏，尽可能分离结缔组织和系膜（注意防止脾脏破裂）； 将取下的脾脏放入装有5mlPBS液的平皿中。 脾细胞提取： 方法 冲洗法 研磨法 制备的细胞数比较少，细胞比较分散 省时，便于大量操作 不能保证细胞的完整性 平镊轻轻夹住脾用5毫升注射器吸取5mlPBS液刺入脾脏冲洗脾细胞； 拔掉针头用注射器吸取平皿中PBS液反复冲洗2-4次，直至脾脏由暗红色变为白色把所获得的细胞悬液收集到15毫升离心管内，加PBS液至10ml（方便离心时配平）； 目的 操作 获得脾细胞 收集离心管配平1500rpm离心10min去上清（沉淀贴壁面朝上倾倒上清） 裂解红细胞 使用吸管（每吸一次大约1ml）吸取2ml冷NHCl裂解RBC混匀细胞后约5min加PBS液至10ml；1500r/min再离心5min，去上清 洗涤细胞 加PBS液5ml洗涤（上下吹打），1500r/min离心10min去上清 。悬浮细胞于1ml的PBS液中混匀 弃上清，向离心管中加入1ml PBS液，充分混匀 计数液100倍稀释：先在EP管里加入990微升PBS液，从混匀液中吸取10微升加入到1.5ml微量离心管中涮一下枪头，反复抽吸几次，充分混匀。 显微镜计数：10×物镜找到细胞层和计数室；40×物镜找到白细胞计数区域。原则是从左到右S形计数，数上不数下，数左不数右 实验四：抗原抗体反应 实验原理： 概念：体内外发生的高度特异性结合反应，其结构基础为抗原表位与抗体超变区抗原结合位点的结构互补。 特点：特异性；非共价键结合；比例要适当 影响抗原-抗体反应的因素： 电解质：0.85%氯化钠溶液； 温度：37℃； 酸碱度：pH6-8。抗原抗体复合物可在一定条件下解离，而免疫学特性不变。 凝集反应：在颗粒性抗原或吸附于颗粒上的可溶性抗原（或抗体）中加入相应的抗体（或抗原），在电解质存在的条件下出现凝集物的现象，称凝集反应。参与反应的抗原如细菌，细胞等，称凝集原，抗体称为凝集素。包括直接凝集反应（玻片反应、试管反应）和间接凝集反应。本次实验为玻片反应。 凝集反应分类：直接凝集反应：试管法和玻片法（反应界面） 间接凝集反应 间接凝集抑制试验 协同凝集反应 抗球蛋白试验 玻片法简便，快速，为定性试验，可做为半定量检测前的筛查试验，因该反应在玻片上进行而被命名玻片法 ，主要用于临床的血型鉴定，菌种鉴定 实验器材：人外周血；抗A、抗B标准血清；（蓝色的为抗A，黄色的为抗B）；玻片（两种），采血针，棉签，酒精等 实验步骤： 准备玻片：取清洁载物玻片一张，于玻片左侧和右侧各加一滴抗A及抗B标准血清 采