生物大分子的分离纯化与鉴定.ppt

生物大分子的分离纯化与鉴定 第一节：引言 什么是生物大分子 生物大分子分离、纯化方法类型 生物大分子分离、纯化过程 第二节：生物大分子制备的前处理 一．生物材料的选择和前处理（pretreatment） 从工业角度考虑 从科研角度考虑 选材时，注意材料的季节性，动物的生理状态，微生物的生长期 材料选定以后要预处理 二．细胞破碎 机械破碎法 ①高速组织捣碎机 利用高速旋转的叶片产生的剪切力将组织细胞破碎。 处理材料量较大时，使用之。 ②匀浆器 匀浆器用来破碎那些比较柔软，易于分散的组织细胞。科研上若材料处理量少，可使用匀浆器。 ③研磨器 二．细胞破碎 2．物理破碎方法 ①反复冻融法 ②超声波破碎法 ---- 超声波多用于微生物细胞的破碎。 二．细胞破碎 3．化学破碎方法：通过化学试剂的作用使细胞膜的透过性改变。 有机溶剂：丙酮，甲苯，丁醇，氯仿等。 表面活性剂：SDS、特里顿（Triton）、氯化十二烷基吡啶、吐温（Tween）等。 二．细胞破碎 4．酶学破碎方法 ①外加酶制剂 ②自溶法 通过细胞本身存在的酶的作用使细胞壁自行破裂。 三．细胞器的分离 细胞器包括细胞核、染色体、线粒体、核糖体、溶酶体、叶绿体等。  1．离心技术 常速离心机； 高速离心机； 超速离心机；  2．分离细胞器的方法 差速离心法 密度梯度离心 等密度离心  四．提取 用一定的溶剂处理样品，使欲分离的物质以溶解状态充分释放到溶剂中的过程。又称为抽提或萃取。 影响提取的主要因素： 提取物在溶剂中的溶解度大小 提取物由固相扩散到液相的难易 溶剂的pH值 提取时间 温度 第三节：分离纯化 一．粗制品的分离方法 蛋白质和酶粗制：盐析法，等电点沉淀法，有机溶剂分级分离法等。 RNA 和DNA的粗制：浓盐法、稀碱法、苯酚法等。 特点：简便，处理量大，既能除去杂质又能浓缩样品。 缺点：分辨率低。 二．精制品的分离纯化方法 离心、柱层析法、电泳法等。 特点：规模小，分辨率高。 三．结晶---物质呈晶状从溶液中析出的过程 生化物质形成结晶的条件： 样品纯度 对于大多数蛋白质来说，一般要求纯度达50%以上才进行结晶。 溶液的饱和度 溶剂的选择 第四节：生物大分子的浓缩，干燥和保存 一．浓缩---从低浓度的溶液中除去水或溶剂使之变为高浓度的溶液的过程。  浓缩的方法： ①沉淀法 ②蒸发浓缩 ③吸收浓缩 ④超滤法 二．干燥---把潮湿的固体、膏状物、浓缩液及液体中的水或溶剂除尽的过程。  真空干燥 冷冻真空干燥 三．样品的保存 1．干粉保存：0~4℃ 冰箱中保存即可（样品置于干燥器中）。 2．液态保存：0~4℃ 冰箱即可。不能放在0℃ 以下，因为结冰会使大分子构象破坏，使其失活。 第五节：生物大分子含量的测定和纯化鉴定 一．含量的测定 测定多糖总量——菲林试剂法，蒽酮法，旋光法等。 测定蛋白质和酶总量——凯氏定氮法，Folin-酚法，双缩脲法，紫外吸收法等。 测定核酸总量——定磷法、紫外吸收法。 二苯胺法测DNA，地衣酚法测RNA。 二．纯度鉴定 蛋白质和酶制品纯度鉴定必须采用2~3种不同的鉴定方法才能确定。 核酸的纯度鉴定从测A260/A280光吸收比值可判定样品的纯度。 RNA，A260/A280≈2以上， DNA，A260/A280≈1.8左右,若DNA的A260/A280＞1.8，说明制剂中存在RNA,需要考虑用RNA酶处理样品，提高DNA纯度。 生物大分子分离、纯化方法 性质 具体方法 分子大小和形态 溶解度 电荷差异 生物功能专一性 差速离心、超率、分子筛、透析 盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀等 电泳、等电点聚焦、离子交换层析、吸附层析 亲核层析、疏水层析、共价层析