DNA测序模板的制备和测序引物设计中的相关问题.pdfVIP

史垦佥至!坚壁痘堂盘查呈坚笙2旦筮璺鲞筮!塑(萱筮!垒翅) DNA测序模板的制备和测序引物设计中的相关问题 王虎王晓健甄一松邹玉宝 郑维越张芊 Q] 6 核酸序列测定是基因研究的重要手段，本世纪 5’三磷酸基团掺人到正在延长的DNA链中，但 60年代和70年代，科学家们一直致力于研究测定核d帅因缺乏3’羟基而不能同后续的姗形成磷酸 酸序列的方法。最初使用的方法只能测定RNA，主要 二酯键，因此，当正在延长的DNA链末端碱基为 是tRNA，一则因为它的链较短，通常只有74—95个核 苷酸，二则有可能分离单个tRNA分子。而DNA的情反应混合物的4种普通心irIP中加人少量的一种 况却大相径庭，人的染色体有大有小，每条染色体约 d心4rIP后，链延伸将与偶然发生却十分特异的链终止 展开竞争，反应产物是一系列的核苷酸链，其长度取 含5千5百万到2亿5千万个碱基对，远远大于RNA 分子，如何将其切割并分离成500bp以下的片段成了决于从用以起始DNA合成引物末端到出现过早链终 止的位置之间的距离，结果将产生4类寡核苷酸，它 DNA序列测定问题的关键。基因克隆(genec10ning)和 c¨n 们分别终止于模板链的每一个A、C、G或T的位 多聚酶链式反应(polymerasereaction，PCR)技术使 从染色体中分离特定DNA片段的难题迎刃而解，快 置￡。 速高效的测序技术因此产生。1977年，基于链终止 和化学降解的DNA测序法研究成功，略经改善后很 脱氧TTP 快就被推广到世界各国的分子生物学实验室，成为 O O O 80年代和90年代序列测定革命的基础。但此种测序 ¨ ¨ ¨ H0一P—o—P一0一P 法的缺点也是显而易见的，一方面操作步骤繁琐，可 OH 0HO 测样本量小，另一方面同位素的使用也明显限制了该 方法的应用。八十年代末期，美国加州一位科学家发 0H 明了世界上第一台DNA全自动测序仪，随着此后技 术的不断成熟与完善，DNA的测序已经实现了高通 双脱氧TTP 量、产业化。由美、英、日、德、法、中六国参与的 O O 0 ¨ ¨ ¨ Genome 人类基因组计划(Hl，mall Pr01ect，HGP)，是人 H0一P—o—P一0一P—o一 类文明史上最伟大的科学创举之一，其核心内容是人 0H 0HOH 类基因组序列图的绘制——测定人类基因组的全部 0H DNA序列，该计划启动于1990年，原定15年完成， 由于技术的成熟与基因组测序的规模化运作，人类基 图l脱氧核苷酸及双脱氧 因组工作框架图构建已于2001年6月全部完成。 核苷酸结构比较 一、测序的原理 BigDye DNA测序方法