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维普资讯 2008年 9月 Sept． 2008 第39卷第5期 内蒙古大学学报(自然科学版) JournalofInnerMongoliaUniversity Vo1．39 NO．5 文章编号：100O一1638(2008)05—0548—04 红色荧光蛋白DsRed2基因在大肠杆菌中的 表达和观察及其在本科实验教学中的应用。 邢万金 ，赵宇航，任仕超，包晓红 (内蒙古大学生命科学学院生物学系，呼和浩特 010021) 摘要 ：用PCR方法从质粒pDsRed2—1中扩增获@~DsRed2，亚克隆到pMD19一T载体上，然后酶 切将DsRed2分别插入到原核表达载体pET—Trx和pGEX一4TI上，转入E．coliBL21(DE3)中， 用IPTG诱导表达．在LB平板培养基上或液体培养基 中直接观察菌体颜色，最后用SDS—PAGE 检测DsRed2蛋 白的表达．结果显示构建的重组载体pET—Trx—DsRed2和 pGEX—GST—DsRed2 在E．coli中成功表达，且不形成多聚体．LB平板培养基上和IPTG诱导24h后的液体培养基中 都能直接观察到红色荧光，说明DsRed2可以作为原核表达系统的报告基因． 关键词 ：原核表达；红色荧光蛋白；DsRed2；实验教学 中图分类号 ：Q812 文献标识码 ：A 红色荧光蛋 白(Redfluorecentprotein，RFP)因其红荧光较强的组织穿透力 ，已被广泛用于动 物、植物和酵母等真核细胞 内基因表达 的报告基因Ci~93．但作为原核细胞表达 的报告基因还鲜有报 道n们．DsRed是Clontech公司改造RFP的一个突变体E57一NA而成的，由225个氨基酸组成，其单体 结构与绿色荧光蛋白(Greenfluorecentprotein，GFP)相似，是 由11条 桶状结构 (3[-barre1)绕成的 一 个圆柱体，一条 a螺旋缠绕在圆柱体的轴位置 ，生色团附着在 a螺旋上，包埋于圆柱体 中㈣．虽然 DsRed在大肠杆菌 中表达后仍然能被激发 出鲜艳的红色荧光 ，但DsRed在E．coli中发光需要形成稳 定的四聚体结构 ，且有一定的发光波长的干扰，影响其作为报告标签的效果．DsRed2是来源于 DsRed的人工突变体，其发光基团在成熟速度上较 DsRed有 了显著的提高，此外还减少了N端的净 电荷 ，缓解了野生型DsRed易形成不溶性聚合体的缺点。”，已经成为真核表达的报告基因．由于真核 基因在原核细胞 中表达后往往缺乏生物活性 ，虽然DsRed在大肠杆菌中表达后仍然能被激发出鲜艳 的红色荧光，但 目前 尚未有 由DsRed改造而成的DeRed2在原核细胞中独立表达或融合表达后能否 保持荧光活性的研究报道．因此本文用带有不同标签的两种原核表达载体pET—Trx和pGEX一4T1在 E．coli中融合表达DeRed2，并观察其荧光发光特性 ，为探讨DeRed2成为原核表达系统的报道基因的 可能性积累资料，并为高校分子生物学和基因工程实验教学课程建立一个基因克隆、原核表达和 目的 蛋白功能鉴定的教学实验． 1 材料和方法 1．1 质粒和菌株 质粒pDsRed2—1由内蒙古大学实验动物研究中心惠赠，pET—Trx(美国基因动力实验室有限公 司)、pGEX一4T1(AmershamBiosciences)、菌株DH5a和BL21(DE3)由本实验室保存．限制性 内切酶、 pMD19一T载体 、XDNA—HindⅢMarker购买于TaKaRa公司，TaqMasterMix、MarkerⅡ购买于天根 + 收稿 日期：2007—12—05 基金项 目：内蒙古大学实践教学改革研究项 目和内蒙古自治区高等学校科学研究项 目(No．NJ05026)资助 作者简介 ：邢万金 (1965~)，男，内蒙古集宁市人，副教授．主要研究方向：分子遗传学．