基因工程抗体概述和基本技术.docVIP

基因工程抗体概述和基本技术 (Genetic Engineering Antibody) 一、 概 述 以生物高技术为手段，将动物淋巴细胞产生的抗体基因，人为地使其在非淋巴细胞中表达，所产生的抗体称基因工程抗体。产生抗体的基因工程是建立在单克隆抗体(McAb)技术之上的，如果说后者是生物科学的一场革命，那么抗体的基因工程技术无疑是这场革命的拓宽和延续。 1975年，Khler和Milstein等创立的B淋巴细胞杂交瘤技术给抗体技术的深入研究及应用带来了突破，单克隆抗体作为临床诊断、治疗、预防及基础理论研究的新型制剂，已日益显示出重要的作用和广阔的应用前景，尤其是McAb或“McAb复合物”对临床某些疾病如肿瘤的治疗作用更引人注意。将McAb与化疗药物、毒素或同位素等连接后，借助McAb的特异性识别，可有效地将治疗性药物运送到靶细胞，这种称为魔弹(magic bullets)的导向药物疗法的出现，曾令人们兴奋不已，以为找到了攻克癌症的尖端武器。尽管这一技术有许多不可比拟的优点，随着研究的深入，也暴露出许多问题，其中最主要的就是难以获得大批量的人类杂交瘤抗体，致使用于临床治疗的McAb绝大多数都来源于小鼠和大鼠。由于人和鼠之间遗传背景的差异，在人体内使用鼠源McAb，会被作为外源性蛋白抗原而产生人抗鼠抗体(human anti-murine antibodies, HAMA)，这种抗体会被迅速清除，如由静脉注入人血液中的小鼠单抗，会妨碍小鼠McAb与抗原或靶细胞的结合，从而降低McAb的治疗效应，更为重要的是HAMA可在人体内与小鼠McAb结合，可产生类似血清病的超敏反应，因而限制了鼠源McAb在临床上的反复使用。最好的办法是应用人源性单抗。但人-人杂交瘤技术尚未出现重大的突破，存在着建株困难、Ig产量太低、稳定性和亲和力差，以及本身还分泌一些杂蛋白等问题。 基因工程抗体技术依赖于两个基础：一是抗体的结构功能关系以及抗体多样性的遗传机制，二是分子生物学技术进展，特别是PCR技术，为基因片段的大量扩增提供了简单有效的途径。基因工程抗体技术的基本原理是，首先从杂交瘤细胞、免疫脾细胞或外周血淋巴细胞中提纯mRNA，逆转录为cDNA，再经PCR分别扩增抗体的重链和轻链可变区编码基因，经适当方式将二者连接形成单链抗体可变区基因片段(single-chain variable fragments, ScFv)，在一定的表达系统中得以表达。另外，重链和轻链可变区基因还能在同一宿主的两个载体中分别表达，然后在胞浆内组装成单链抗体可变区片段(ScFv)，或二价抗体片段。这种单链抗体在其N末端或C末端可进一步与毒素、葡萄球菌蛋白A、碱性磷酸酶、T细胞受体及单链抗体片段本身融合，这些蛋白质既有抗原结合能力，又有其融合蛋白的生物活性，因此这类蛋白被称为“双功能抗体”。 二、 抗体的基因结构 抗体是由二硫键相连的两条轻链(L链)和两条重链(H链)构成的活性多肽蛋白分子。具有两个功能区：一为特异性结合抗原区，位于抗体L、H链的可变区(V区)，一为稳定区(C区)。免疫球蛋白的轻链和重链是由两个不同类型的基因分别编码的，属于多基因家族。Ig的V基因和C基因均由多个外显子组成，Ig分子的每一个多肽区由不同的外显子编码，尤其是重链基因，有多个外显子供选择，这也是抗体形成多样性的物质基础，如编码Ig重链VH的基因有多个基因片段(VH1～VHn)供选择，与VH基因连接的还有多样性基因节段(DHa～DHx)，连接链基因片段(JH1～JH6)和决定重链种类的恒定区基因片段(Cμ～Cε)。这些基因在DNA水平上切断、重组，在RNA水平上拼接，根据与哪一类C基因片段连接，即组成哪一类Ig，Tonegawa(1976)和Early(1980)等先后证明免疫球蛋白肽链的合成由位于常染色体上彼此不相连锁的三个基因群(重链、γ链和κ链基因群)所编码。而且重链和轻链的C区和V区以及V区基因本身也不是连续的基因编码。V区由V、J两个基因控制。另外，胚胎DNA的V基因还有一个引导基因(leader gene)称为L基因，编码约17～20个氨基酸的疏水引导肽段。当有抗原刺激时，B细胞分化伴有突变发生，编码Ig的DNA经过V、J和V、D、J(编码H链基因)基因的随机重排方能形成功能的Ig基因，使编码的IgV区具备独特、多变的结构。转录成RNA，经加工剪接后形成成熟的mRNA，方能翻译出Ig的L链和H链。杂交瘤技术使得从分泌特异性鼠McAb的杂交瘤细胞中获得特异活性Ig基因组成成熟的mRNA成为可能，蛋白质基因工程技术使得两种来源不同的编码Ig的结构基因重组相嵌，获取目的性基因片段，舍弃非目的性基因片段。从而构建成嵌合Ig基因克隆，经表达而制成嵌合McAb。 三、 制备基因工