PCR技术应用一诊断单基因疾病.pdfVIP

中国试剂网 3.9.58 PCR 技术应用一：诊断单基因疾病 自 1987 年秋以来，PCR 技术的应用开创性地推动了产前单基因缺陷者及携 带者的 诊断。目前PCR 还不能用于诊断所有已知缺陷疾病，但极大地扩大了实 验诊断学家对 诊断方法的选择。JohnHopkins 大学的研究人员表明，在诊断基因 缺陷疾病方面 PCR 技 术具有快速、准确、操作灵活等特点。每项进展的实例在 以后描述。在 1987 年 10 月 前，我们用 Southern 印迹法产前诊断镰刀红细胞贫 血症通常需要两周或更长时间，而 1987 年 10 月以后，应用 PCR 只需 24 天。 在 1987 年以前，几乎所有的 β－地中海贫血症 的产前诊断都是通过检测在 β－ 珠蛋白簇中连锁 DNA 的多态间接完成的，一般需要24 周。1987 年 10 月以后， 用 PCR 扩增 β－珠蛋白基因区后，直接检测致病突变即可完成 β －地中海贫血 症的产前诊断。这个方法既增加了准确性，又缩短了时间，一般只需 一周时间。 该项改进技术的作用，（1）如果我们不能确定在父母双方中 β －地中海 贫血的 突变位置，我们还可以在 1、2 天之内研究 β－珠蛋白基因簇中DNA 的多态性； （2 ）通过比较母亲与胎儿 DNA 序列差别来判断母亲传染的程度。这只是说明 PCR 对基 因诊断意味着什么的几个例子。以下我们举几个特例具体说明PCR 技 术的应用： （1）通过扩增产物的打点杂交或限制性内切酶酶解方法确定已 知的点突变； （2 ）通过对扩增产物直接测序来发现已知或未知的突变； （3 ）通过改变 PCR 扩增产物的大小或产物不能特异扩增来发现异常缺失； （4 ）通过对DNA 多态性研究来间接诊断致病突变。最后，还将讨论 PCR 技术 的技 术性难点、重要控制条件及局限性。 产前基因诊断基础知识 产前基因诊断是逐步发展起来的，而且在不断完善。1978 年 Kan 和 Dozy 提出应用 与 β－蛋白基因连锁的 DNA 多态性来间接诊断镰状红细胞贫血。此种 诊断需要进行家 族性研究，以确定父母双方的多态性等位基因类型，此等位基 因型是用正常 β－珠蛋 白基因及镰状红胞β－珠蛋白基因探知的。家族被调查成 员包括夫妇俩的孩子，如没 有孩子，则调查夫妇双方的父母。到 1982 年，通过 利用 Mst Ⅱ限制性内切酶方法可以 直接产前诊断是否有镰状红细胞贫血，因为 内切酶Mst Ⅱ及其同功酶Cv 嗷蛳 xn Ⅰ不能 在突变位点降解镰状 β－珠蛋白基 因而可在此位点降解正常 βA－珠蛋白基因。这种 改进不需家族调查，就可更准 中国试剂网 3.9.58 确地进行镰状贫血病的产前诊断。正是这种改进法，使 直接而简便地确定致病 突变成为可能，这也是我们在所有基因诊断研究中所力求的。 单基因缺陷的诊断是通过对连锁 DNA 多态性研究及家族研究而确定的。到 1988 年 底，我们利用这种方法诊断了一些患 Duchenne 肌营养不良症病人、大 多数甲型和乙型 血友病人、所有囊性纤维变性病人及 Huntington 氏病、神经性 纤维瘤和成人多囊肾病 人。应用这种技术同时直接发现了镰状红细胞贫血、β －地中海贫血、α 地中海贫血 有大多数 Duchenne 肌营不良症、部分甲型血友病 和成视网膜细胞瘤病人的致病突变。 几乎所有这些病例中，由于重要的 DNA 序列是已知的，所以PCR 技术在产前诊断、症发 前诊断及携带者发现等方面具 有非常重要的价值。 应用 PCR 技术直接发现点突变 在点突变诊断中，继 PCR 技术之后可用三种技术一打点杂交、酶切分析及 直接测 序。John Hopkins 大学研究人员应用以下几步来诊断镰状红细胞贫血： （1）将人绒 毛膜样品 （CVS ）或羊水中得到的胚细胞在 2MNaCl ，0.1 aOH 溶液中煮沸。（2 ）应用 PCR 技术在 β 珠蛋白基因 5末端扩增一个 725bp 区，用 30 个循环，72℃链延伸 120