质粒pRSET-A前导肽串联多聚体的构建及其多克隆抗体制备.pdfVIP

中国生物工程杂志China Biotechnology，2008，28(9)：77—82 质粒pRSET-A前导肽串联多聚体的构建 及其多克隆抗体制备木 黄运茂1 岳光芳2 刘 丽2 刘 颖2 李万利2 施振旦2” (1仲恺农业工程学院生命科学学院广州510225 2华南农业大学动物科学学院广州510642) 摘要质粒pRSET．A是一个常用的高效原核表达载体，编码一N端舍组氨酸标签(6×His)的 34aa前导肽序列，以方便利用抗组氨酸标签抗体鉴定或纯化所表达的重组蛋白。实验设计一对 两侧含编码疏水性氨基酸密码子的引物，经过扩增前导序列lO一34aa基因序列，并重新克隆入质 粒pRSET-A构建串联二聚体后，再利用质粒pRSET—A的BamHI／尉II同尾酶克隆位点，经一 系列简单的酶切和连接，快速构建这一前导肽中不合组氨酸标签序列的串联多聚体基因，并成功 表达其六聚体重组蛋白。将此重组蛋白主动免疫山羊，获得了能够特异地识别pRSET—A编码的 N端前导肽序列的抗体。结果显示，所制备的羊抗10—34aa前导肽抗体能够识别pRSET．A指导 表达的含有完整前导肽的重组蛋白，但不能识别不含10～34aa序列的重组蛋白；同时，利用同位 酶技术可以快速高效构建短肽的串联多聚体以制备具有高免疫原性的亚单位疫苗或免疫调控 蝴表， 关键词质粒 串联多聚体抗体制备应用 中图分类号Q784Q786 在重组蛋白的构建中，常利用针对性的抗体通过 氨酸纯化标签序列的部分前导肽序列，快速高效构建 免疫印迹检验所表达蛋白的正确性。由于人类和动物 串联六聚体的重组基因，并检验所表达的六聚体蛋白 基因组研究的快速发展，不断需要利用抗体通过免疫 的免疫原性、免疫动物后所产生抗体的免疫特异性，为 印迹识别新发现的基因及其蛋白。在缺乏针对目的蛋 制备针对短肽抗原的抗体提供新的思路，同时制备鉴 白的抗体时，一般使用针对表达质粒编码的纯化标签 定识别利用pRSET—A表达的重组蛋白的抗体，以便于 (如组氨酸标记等)或前导肽序列的抗体进行鉴定，使 今后研究工作的开展。 得这些抗体的售价非常昂贵。而在生产基于短肽抗原 l材料与方法 亚单位疫苗的设计中，常常需要通过制作多聚体抗原 以增加其分子量来提高短肽的免疫原性uJ。一般的克 1．1材料 隆技术很难同时兼顾酶切位点数量和克隆操作次数， 表达菌Ecoli 使多聚体制备中的基因克隆变得非常繁琐。本研究则 利用实验室中常用的高效原核表达质粒pRSET—A，利 的重组菌表达样均由华南农业大学动物遗传与繁殖实 用pRSET—A质粒多克隆位点中的两个同尾酶位点 BamH I和WII，探讨仅利用酶切和连接的简单克隆 方法，将pRSET—A质粒中位于多克隆位点之前、不含组 肌I／Hind I／Hind III[2]和BamH m[3]构建而成；由 于舭I位点在载体阅读框架内紧靠6个组氨酸，因此 收稿日期：2008-02．18修回日期：2008舶埘 ·广东省自然科学基金资助项目 重组子pR-chLepl所表达重组蛋白不含载体克隆位点 }}通讯作者，电子信箱：zdshi@∞¨．edu．cn 前的前导肽序列，分子量为17．5kDa[21，而重组子pR． 万方数据 78