白介素21基因联合放射对子宫颈癌HeLa细胞的协同抑制作用.pdfVIP

其它研究 [关键词]IL一2l基因；子宫颈癌；照射 人白细胞介素21(IL-21)是2000年发现的I型细胞因子家族中的新成员，主要由活化的 基组成的多肽，相对分子质量为15×103D。现已证实IL一21与移植排斥反应及自身免疫病密切 相关。有研究报道，将IL一21基因导入肿瘤细胞内，可以促使肿瘤局部T细胞的增殖、活化、 增加IFN—r的分泌，促进Nl(细胞的分化成熟，从而加强NK、cTL细胞的细胞毒活性，发挥抗肿 瘤作用。本研究采用已构建好的含有IL-2l基因的重组腺病毒(Ad—IL一21)转染人宫颈癌细胞系 HeLa，联合Y射线照射，观察IL一2l基因联合放射对HeLa细胞的协同抑瘤作用，为进一步开 展IL-21基因在肿瘤治疗中的应用奠定基础。 材料与方法 1640培养基，置5％ 1．人子宫颈癌HeLa细胞：由本实验室保存。用含lO％d,牛血清的RPMI C02、37℃培养箱中培养。 2．主要试剂和仪器：RPMI 公司)，Taq Annexin 11 PVDF膜(Mi cruz公司，scl30195)，二抗辣 ipore公司)，一抗兔抗IL-21抗体(美国Santa 7Cs 根酶标记羊抗兔抗体(北京中衫金桥公司，ZDR5306)．13Y射线照射源(USD，加拿大，吸收 剂量率为0．75Gy／min。 3．分组：数字随机表法分为空白对照组(不做任何处理)、Ad—LacZ对照组(含lacZ基因 80％汇合的293A细胞，进行病毒的扩增，2～3d待细胞大部分发生病变并从底部脱落后，收获病 毒液。采用TCID50方法测定腺病毒的滴度。 5．流式细胞术检测HeLa细胞周期及凋亡率：于转染前1天取对数生长期HeLa细胞，按每孔 MOI l×105个细胞／4L接种于6孔培养板，转染当天按上述分组处理，每组4个平行样，每孔加100 Ad—IL一21(病毒滴度为9X 10”pfu／m1)。转染48h后收集细胞，每组各取2孔用冷PBS液洗2次， 75％冰乙醇固定lh，-20℃保存。检测前用冷PBS液洗2次后加入500ul碘化丙啶(PI)，混匀， 暗处避光反应30rain，上流式细胞仪488nm波长检测细胞周期。每组各取另2孔，用冷PBS液洗3 pl Annexin pl 次，弃上清后加入10 V-FITC和500PI，混匀，避光室温反应15min，上流式细 胞仪488nm检测细胞凋亡率。 X 6．HeLa细胞内IL-21基因表达的变化：于转染前l天取对数生长期HeLa细胞，按l10。个 MOI 细胞接种于培养瓶内，转染当天按上述分组处理，每组加100 Ad—IL一21。转染48h后按照 GGC3’，下游引物： 扩增片段为305bp。PCR扩增IL-2l基因，上游引物：5’ATGAGATCCAGTCCT 5’TCAGGAATCTTCACTTCC3’。扩增片段为493 共25个循环。PCR产物行1％琼脂糖凝胶电泳，半定量RT—PCR分析IL一2l基因的表达。 7．Western X MOIAd—IL一2l。 细胞，按1 107个细胞接种于培养瓶内，转染当天按上述分组处理，每组力n100 转染48h·后按照试剂盒的操作方法提取蛋白。将蛋白样品和预染蛋白marker行SDS聚丙烯酰胺 222 其它研究 凝胶电泳2h，依据marker切下位置正确的凝胶，放到