质粒DNA的转化及筛选（年制）.pptVIP

质粒DNA的转化及筛选 CaCl2法感受态制备 感受态是指受体细胞处于容易吸收外源DNA的一种生理状态，可以通过物理与化学方法诱导形成。 实验步骤 细菌感受态的制备： 1，Top10菌株培养过夜，以1:100比例接种培养3小时，冰浴30min，分装于EP管，2500rpm 4℃离心4min。 2,弃上清，沉淀重悬于1ml预冷0.1mol/LCaCl2 ，冰浴15min，2500rpm 4℃ 离心4min。 3，弃上清，沉淀轻悬于0.2ml预冷0.1mol/L CaCl2 (此时细菌易破碎)，置冰浴。 转化： 1，加入质粒DNA 20?l，冰浴30min。 2，42℃热冲击2min ，迅速冰浴2min。 3，加1ml Amp－ LB培养基，37℃振荡 培养1小时（250rpm/min）。 + 20 基本原理： 细菌处于0℃的CaCl2低渗溶液中，会膨胀成球形，细胞膜的通透性发生变化 转化混合物中的质粒DNA形成抗Dnase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经过42℃短时间的热激动处理，促进细胞吸收复合物 在丰富的无抗生素培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，在选择培养基上可获得所需的转化子。 蓝白筛法 α互补 IPTG 载体质粒DNA带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码?-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型?-半乳糖