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快速酶触反应及代谢产物的检测 1.定义 快速酶触反应是根据细菌在其生长繁殖过程中可合成和释放某些特异性的酶，按酶的特性，选用相应的底物和指示剂，将它们配制在相关的培养基中、根据细菌反应后出现的明显的颜色变化，确定待分离的可疑菌株，反应的测定结果有助于细菌的快速诊断。 2.应用 快速酶触反应可应用于以下几个方面：微生物酶活的测定，细菌计数，微生物种属鉴定。 2.1微生物酶活测定——以MTT分析法为例 MTT全称3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，为黄色染料 ，能接受被细胞内线粒体脱氢酶活化的氢原子 ，还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，产生甲臜的量与酶活成正比，二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲臜。在510nm测得其光吸收，对底物浓度作图即可表示该底物浓度下的酶活。 2.2快速酶触反应用于细菌计数 注：由于过量的TTC可抑制细菌生长, TTC用量选择应以不抑制菌体生长,又能灵敏显示细菌数目为宜。 Petrifilm是美国3M公司发明的一种用于菌落计数的可再生的水合物干膜,由上下两层薄膜组成,下层的聚乙烯薄膜上印有网格并且覆盖有培养基,上层是聚丙烯薄膜。培养基中含有微生物生长及生化试验所需的营养及试剂,并通过一种冷水可溶性的凝胶剂附着在上下两层膜上。生化试剂有特异性显色物质和抗生素。 2.3快速酶触反应用于微生物鉴定 快速酶触反应用于微生物鉴定包括以下几种方式（或者说经历了一下几个发展阶段）：平板培养，纸片法，Petrifilm测试片，API鉴定系统，Biolog全自动微生物鉴定仪。 Ⅰ.平板培养 沙门氏菌的鉴定：据Manafi等报道，沙门氏菌属（包括各亚属）均产生辛酯酶，可以用来鉴别沙门氏菌与肠杆菌科其它属细菌。 Aguirre等用意大利Biolife公司试剂“MUCAP Test”证明该法对沙门氏菌有很高的敏感性和特异性，操作也十分简便、快速。 中华人民共和国进出口商品检验行业标准SN 0332-94即为用4-甲基伞形酮辛酯 (MUCAP)试剂对沙门氏菌进行检验的方法。 沙门氏菌可特异的分解MUCAP中的辛酯,使4-甲基伞形酮游离.游离的4-甲基伞形酮用长波紫外光灯照射发蓝色荧光，从而使沙门氏菌得到证实． 大肠埃希氏菌鉴定：大肠埃希氏菌具有β-葡萄糖醛酸酶，可分解吲哚酚-β-D-葡糖苷酸（indoxyl-β-D-glucurondie，IBDG）产生不溶性靛蓝色素。将一定量的IBDG加入到麦康盖培养基琼脂中制成MAC-IBDG平板，35℃培养18小时，出现深蓝色菌落者为大肠埃希氏阳性菌株。 但以O157：H7菌株为代表的肠出血性大肠埃希氏菌（EHEC）却不具此酶，故β-葡萄糖醛酸酶阴性已成为初步筛查EHEC的重要特征。 　1982年美国首次报道了由EHEC O157:H7引起的出血性肠炎暴发。此后，世界各地陆续报道了该菌引起的感染，并有上升趋势。 O157感染症状通常是突然发生剧烈腹痛和水样腹泻，数天后出现出血性腹泻，可发热或不发热。 严重者可导致死亡。 Ⅱ.Petrifilm测试片 大肠菌群、大肠杆菌测试纸片：该测试片含有改良的VRB (Violet Red Bile)培养基及葡萄糖苷酸酶指示剂。绝大多数大肠杆菌能产生β - 葡萄糖苷酸酶,与培养基中的指示剂反应,产生蓝色沉淀环绕在大肠杆菌菌落周围,表面覆盖的胶膜,可留住发酵乳糖产生的气体,形成蓝色和深蓝色的菌落并有气泡相连。大肠菌群菌落在测试片上产酸, pH指示剂使培养基变为暗红色,在红色菌落周围有气泡者为大肠菌群。所以,一次测试即可测出大肠杆菌和大肠菌群数:带气泡的蓝色和红色菌落为大肠菌群,带气泡的蓝色菌落为大肠杆菌。 区分出大肠杆菌和大肠菌群具有重要意义：（1）大肠杆菌为肠道内非致病菌，大肠菌群很多为有害菌，将粪便中的两类菌分类及计数能表征人或牲畜健康状况；（2）计数污水中大肠杆菌和大肠菌群总数可以作为污水受粪便污染程度的参考指标。 Ⅲ.API鉴定系统 API（Analytic Products INC）鉴定系统是由法国生物—梅里埃公司生产的细菌数值分类分析鉴定系统。该系统目前约有1000种生化反应，可鉴定的细菌大于550种。是世界范围内应用最广、种类最多、最受微生物学家推崇的国际标准化产品，被称为细菌鉴定的“黄金标准”。 API鉴定系统的原理：API系统用于细菌鉴定的品种有15种，分别有相应的数据库。数据库由细菌条目（taxa）组成，每个条目可能因情况的不同代表细菌种、细菌的生物型、细菌的菌属。鉴定主要依据API试剂条的生化反应结果将一种、组细菌与其它细菌相鉴别。 利用API鉴定系统进行细菌鉴定，常规的分离培养是必不可少的。分离培养后挑选可疑菌落进行预试验，如革兰氏染色、镜检、氧化酶实