节旋藻色基裂合酶基因cpcS,cpcT,cpcU的克隆及在有光学活性藻蓝蛋白β亚基生物合成中的功能研究.pdfVIP

万方数据 谨以此论文献给我敬爱的导师，默默奉献的家人 和一直支持帮助我的实验室同学们 张冉 万方数据 万方数据 万方数据 节旋藻色基裂合酶基因cpcS， cpcT，cpcU的克隆及在有光 学活性藻蓝蛋白β亚基生物合成中的功能研究 摘要 钝顶节旋藻 (Arthrospiraplatensis) 是一种具有很高营养价值的经济微藻，其 富含藻蓝蛋白，藻蓝蛋白具有抗氧化，抗肿瘤等作用，还可作为一种天然色素， 广泛用于医药、食品、化妆等行业，此外由于其所特有的荧光活性且无毒，还可 用作荧光标记物及光动力治疗等领域。近年来，通过基因工程手段表达具有光学 活性藻蓝蛋白研究取得了较多的成果，为有光学活性藻蓝蛋白的应用及构建新的 光合系统提供了基础。 光学活性藻蓝蛋白的合成过程中重要的一步是藻蓝胆素与脱辅基蛋白的共 价偶联，而藻蓝胆素与脱辅基蛋白的正确连接需要特定的色基裂合酶的催化。光 学活性藻胆蛋白的生物合成一般需要脱辅基藻蓝蛋白（CpcA,CpcB），色基合成 酶（Hox1,PcyA），色基裂合酶三种元件的共同参与。本实验室前期关于节旋藻 藻蓝蛋白α亚基的色基裂合酶的研究已经比较完整，但是还没有关于节旋藻藻蓝 蛋白β亚基色基裂合酶的研究，因此本论文克隆了节旋藻藻蓝蛋白β亚基的色基裂 合酶，并研究了其功能。 本论文首次克隆了钝顶节旋藻A.platensis FACHB314 的色基裂合酶基因 cpcS，cpcT和cpcU，其中cpcS全长594bp，编码197个氨基酸序列，分子量为 22.1kDa，blastp 比对其属于CpeSsuperfamily，存在5个保守结构域，分别是 THHL，ENH，LRERGYAEI，YETM和ERF，氨基酸序列的同源比对结果显示 与其他蓝藻的序列相似度为72.52%；cpcT基因全长597bp，编码198个氨基酸 残基，等电点为5.29，分子量为22.8kDa，blastp 比对其属于CpeTsuperfamily， 具有FSN，NPP，AHI，RPL，EQAY，PYR和FKG七个保守结构域，氨基酸序 列的同源比对结果显示与其他蓝藻的序列相似度为71.14%；cpcU 基因全长 525bp，编码174个氨基酸残基，等电点为5.30，分子量为19.2kDa，blastp 比对 其属于CpeSsuperfamily，具有7个保守域，分别是EFF，SAGKWFS，GKS， EER，PNLR，ASF和SEIR，氨基酸序列的同源比对结果显示与其他蓝藻的序列 万方数据 节旋藻色基裂合酶基因cpcS,cpcT,cpcU 的克隆及在有光学活性藻蓝蛋白β亚基生物合成中的功能研究 相似度为73.22%。 为了研究节旋藻的色基裂合酶CpcS，CpcT和CpcU在藻蓝蛋白β亚基与藻蓝 胆素结合过程的作用，本实验构建了3个重组表达载体：pACYCDuet-cpcB-cpcS （含有藻蓝蛋白β 亚基基因 cpcB 和色基裂合酶 cpcS 基因 ）， pACYCDuet-cpcB-cpcT （含有藻蓝蛋白β亚基基因cpcB和色基裂合酶cpcT基因） 和pACYCDuet-cpcB-cpcU（含有藻蓝蛋白β亚基基因cpcB和色基裂合酶cpcU基 因），并将这3个载体和pACYCDuet-cpcB （仅含有藻蓝蛋白β亚基基因cpcB）分 别与pET24-hox1-pcyA （含有色基合成酶hox1和pcyA 基因）一起转入大肠杆菌 BL21 中，构建重组表达菌株BS，BT，BU和B，并诱导蛋白表达，SDS 和WesternBlotting检测蛋白的表达情况，荧光光谱检测重组蛋白的荧光强度， 结果显示重组菌株中均表达出了藻蓝蛋白，而且有色基裂合酶存