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sgRNA设计方法吉荧生物genebio
SgRNA 设计方法
SgRNA (small guide RNA 简称),是CRISPR 基因敲除敲入系统
中重要的组成部分,早先发现的guide RNA,由两部分组成—tracRNA
和crRNA, 两部分融合表达后,即sgRNA 也能很好的行使guide 的功
能,与cas9 蛋白结合,引导cas9 酶靶向基因组DNA 进行剪切。
SgRNA 脱靶问题一直备受关注,如何设计特异性好的靶点成为
大家关注的焦点,很多实验室开发了不同的设计软件,大体原则如下:
(1)对于sgRNA 的长度,一般应为20 nt 左右;
(2 )对于sgRNA 序列的碱基组成,可选3末端含GG 的
sgRNA,同时 sgRNA 种子序列尽量避免以 4 个以上的 T
结尾,GC%含量最佳为40%~60% ;
(3 )sgRNA 的种子序列与脱靶位点的匹配数尽可能低
(4 )如果构建U6 或T7 启动子驱动sgRNA 的表达载体,
需考虑sgRNA 的5 碱基为G 或GG,以提高其转录效率;
(5 )对于sgRNA 靶向基因的结合位置,如需造成基因移
码突变,需尽量靠近基因编码区的ATG 下游,最好位于第
一或第二外显子;
(6 )检查sgRNA 靶向结合位点基因组序列是否存在SNPs;
(7 )如采用Cas9 单切口酶,设计paired-gRNA 需考虑成
对sgRNA 的间距;
(8 )全基因脱靶效应分析,需考虑脱靶位点最大允许几个
错配碱基数,建议最少5 个碱基。重点考察种子序列和非
种子序列碱基错配数,以及脱靶位点是否位于基因编码区
等,另外还可考察是否存在碱基插入或缺失的脱靶位点。
另外SgRNA 的活性与CRISPR 系统的突变效率直接相关,好的
sgRNA 靶点,会带来更高的突变效率,更多的阳性克隆,在后期筛
选和鉴定时都能事半功倍,所以在着手进行基因编辑前,设计并找到
有活性的靶点至关重要。通常在设计特异性靶点后,需要进行体外细
胞活性筛选,筛选出有效的靶点用于后续实验。
如何设计特异性好的sgRNA:
1、 如果软件中有你需要的物种基因组序列,可以在下列网站
中设计。
1、/
2、/mpg/crispr_design/
3、/~slin/cas9.html
4、/E-CRISP/
5、/
6、/crispr/, Drosophila
7、/index.jsp
8、/casot/index.php
9、/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx
10、/
11、/
12、/cgi-bin/CRISPR 植物
SgRNA 设计靶序列选择:
根据提供的物种、基因名称或者基因 ID 在 NCBI 或
ENSEMBLE 中进行查找。找到该基因CDS 区,分析相应
的基因组结构,明确CDS 的外显子部分。按照基因本身的
性质,选择候选的待敲除位点,确定待敲除位点。对于蛋
白编码基因,如果该蛋白具重要结构功能域,可考虑将基
因敲除位点设计在编码该结构域的外显子;如果不能确定
基因产物性质,可选择将待敲除位点放在起始密码子ATG
后的外显子上。如果是 microRNA ,可以将待敲除位点设
计在编码成熟 microRNA 的外显子或在编码成熟
microRNA 的外显子的5 ’和3 ’侧翼序列。
确定待敲除位点后,选择23
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