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SgRNA 设计方法 SgRNA （small guide RNA 简称），是CRISPR 基因敲除敲入系统 中重要的组成部分，早先发现的guide RNA，由两部分组成—tracRNA 和crRNA, 两部分融合表达后，即sgRNA 也能很好的行使guide 的功 能，与cas9 蛋白结合，引导cas9 酶靶向基因组DNA 进行剪切。 SgRNA 脱靶问题一直备受关注，如何设计特异性好的靶点成为 大家关注的焦点，很多实验室开发了不同的设计软件，大体原则如下： （1）对于sgRNA 的长度，一般应为20 nt 左右； （2 ）对于sgRNA 序列的碱基组成，可选3末端含GG 的 sgRNA，同时 sgRNA 种子序列尽量避免以 4 个以上的 T 结尾，GC%含量最佳为40%~60% ； （3 ）sgRNA 的种子序列与脱靶位点的匹配数尽可能低 （4 ）如果构建U6 或T7 启动子驱动sgRNA 的表达载体， 需考虑sgRNA 的5 碱基为G 或GG，以提高其转录效率； （5 ）对于sgRNA 靶向基因的结合位置，如需造成基因移 码突变，需尽量靠近基因编码区的ATG 下游，最好位于第 一或第二外显子； （6 ）检查sgRNA 靶向结合位点基因组序列是否存在SNPs； （7 ）如采用Cas9 单切口酶，设计paired-gRNA 需考虑成 对sgRNA 的间距； （8 ）全基因脱靶效应分析，需考虑脱靶位点最大允许几个 错配碱基数，建议最少5 个碱基。重点考察种子序列和非 种子序列碱基错配数，以及脱靶位点是否位于基因编码区 等，另外还可考察是否存在碱基插入或缺失的脱靶位点。 另外SgRNA 的活性与CRISPR 系统的突变效率直接相关，好的 sgRNA 靶点，会带来更高的突变效率，更多的阳性克隆，在后期筛 选和鉴定时都能事半功倍，所以在着手进行基因编辑前，设计并找到 有活性的靶点至关重要。通常在设计特异性靶点后，需要进行体外细 胞活性筛选，筛选出有效的靶点用于后续实验。 如何设计特异性好的sgRNA: 1、 如果软件中有你需要的物种基因组序列，可以在下列网站 中设计。 1、/ 2、/mpg/crispr_design/ 3、/~slin/cas9.html 4、/E-CRISP/ 5、/ 6、/crispr/, Drosophila 7、/index.jsp 8、/casot/index.php 9、/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx 10、/ 11、/ 12、/cgi-bin/CRISPR 植物 SgRNA 设计靶序列选择： 根据提供的物种、基因名称或者基因 ID 在 NCBI 或 ENSEMBLE 中进行查找。找到该基因CDS 区，分析相应 的基因组结构，明确CDS 的外显子部分。按照基因本身的 性质，选择候选的待敲除位点，确定待敲除位点。对于蛋 白编码基因，如果该蛋白具重要结构功能域，可考虑将基 因敲除位点设计在编码该结构域的外显子；如果不能确定 基因产物性质，可选择将待敲除位点放在起始密码子ATG 后的外显子上。如果是 microRNA ，可以将待敲除位点设 计在编码成熟 microRNA 的外显子或在编码成熟 microRNA 的外显子的5 ’和3 ’侧翼序列。 确定待敲除位点后，选择23