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第37卷 分析化学(RNⅪHUAXUE) 增刊 ChineseJournal F005 2009年10月 ofAnalyticalChemistry 亲和毛细管电泳研究谷氨酸底物循环双酶反应 杨丽‘ 石婧 陈翠杰 王少敏 郭黎平 (东北师范大学化学学院，长春130024) 近年来，毛细管电泳(CE)【1】以及固定化的酶反应器【21在生命体系中的酶催化反应以及药物 的高通量筛选等研究中得到广泛的应用。本实验制备了一种新型的双酶微反应器，研究了谷氨酸 底物循环反应，对临床医学、神经生物学以及食品化学的谷氨酸测定研究具有重要意义。 CLl020高效毛细管电泳仪(北京彩陆科学仪器有限公司)。CE条件：10cm高差进样5s，_20 o．d．)长度为30cm，有效长度为 l(v分离，340nm紫外检测。酶微反应器(50岫i．d．；365gm 22cm。 GPT(EC2．6．1．2，美国MP 12mol／LHCl溶液处理(800C，12h)毛细管后，依次用去离子水、三氯乙烯、甲醇和丙酮清洗， h)。APTES甲苯溶液(10．O％)冲洗lh。修饰后的毛细管放置140。C烘箱中 N2吹干(1400C，1 6 7．0的磷酸 h后依次用甲苯、丙酮和50mmol／L磷酸(pH7．O)清洗。戊二醛配置在50mmol／L pH h。GDH(100u／mL)和GPT(100u／mL)混合 缓冲溶液中(10．0％)，充满毛细管，放置室温12 溶液持续泵入毛细管中达30min，室温反应lh后4。C反应24h。制备的微反应器使用前储存于 50mmol／L7．0Tris磷酸缓冲溶液和40C冰箱中。 pH 通过底物循环，大大提高了谷氨酸测定灵敏度。反应的产物和反应物在毛细管内CE分离， 二酸斗NH4++NADH：GPT催化：Or-戊酮二酸+丙氨酸一戊酮酸脂+谷氨酸。 双酶固定的毛细管内壁呈现很多均匀的突起，极大增加毛细管内表面积，有利于流动相和固 定相的相互作用；紫外吸收(最大吸收267nm)和荧光光谱(激发波长260nm，最大荧光发射 327 毛细管内壁上，且没有改变两种酶的结构。兼顾酶的稳定性和反应活性，选择10mmolfL％s．磷 7．4)。NAD+和丙氨酸的最优浓度分别为1．0mmol／L和20mmol／L。 酸溶液作为CE缓冲溶液(pH 双酶微反应器在谷氨酸浓度为0--100 1．tm范围内，产物NADH的强度和谷氨酸浓度呈很好的线性 关系氓2--0．9990)，对谷氨酸的检出限达到了0．15llm(S／N=3)。20种在生物样品中可能存在的氨 基酸都没有明显的干扰，表明谷氨酸测定专一性，可用于生物样品中谷氨酸的精确测定。 谷氨酸双酶反应的米氏常数‰为0．61 的‰值(2．68 中不加入丙氨酸实现)测得的如值(2．56 固定对于固定化的GDH的催化能力没有影响。在同实验条件下，获得溶液中的双酶反应的‰为 O．28mmol／L(RSD=8．6％)，可能原因是自由酶溶液中，所有可能的酶分子的活性位置都可以与底 物结合，从而使得酶与底物的亲和性增加。 References 1 J，HoogmartensJ，VanSchepdaelA．Electrophoresis，2008，29：56^65 Zhang 本文系国家自然科学基金(No，吉林省科技厅青年基金(No．202108505)和校内测试基金资助项目 431 +E-mail：yangL330@neli．t1．adu．en；Td：+8