D-甘露糖异构酶在大肠杆菌中的表达及催化条件的研究.pdf

第38卷第1期 北京化工大学学报(自然科学版) V01．38，No．I of of 20ll 2011焦 Journal Chemical Science) BeijingUniversity Technology(Natural D．甘露糖异构酶在大肠杆菌中的表达及 催化条件的研究 ’ 刘 琦1 李 强2‘ 袁其朋1 冯 嵬1 (I．北京化工大学生命科学与技术学院，北京100029；2．清华大学化学工程系，北京100084) 摘要：根据已知的放射性土壤杆菌体内的D．甘露糖异构酶(Fmi)氨基酸序列，设计适合在大肠杆菌内表达的 Fmi基因序列(1245 h酶活达5．29U／mL。以25％的果糖溶液为底物时，催化2h果 催化的最适pH值为7．5，最适温度为45℃，催化1 糖转化率达29．4％。 关键词：D．甘露糖；D-甘露糖异构酶；基因拼接；表达载体 中图分类号：Q786 泰威克生物技术有限公司；宿主大肠杆菌TOPIO感 引 言 受态，大肠杆菌BL21(DE3)感受态，盖宁公司。 D．甘露糖异构酶(EC5．3．1．7)可催化D一甘露1．2工具酶和试剂 糖可逆性转变成D．果糖，D-甘露糖是许多多糖和糖 工具酶，TaKaRa公司；各种试剂盒，天根生化科 蛋白的组成成分，常用于合成药物，同时能作为添加 技(北京)有限公司；酵母提取物、大豆蛋白胨，Oxoid 剂有效地抑制肠内沙门氏菌的增殖。目前市场对 公司；色谱纯乙腈，Merch公司；其他化学试剂均为 D-甘露糖的需求日益增多，采用化学法制备D一甘露 国产或进口分析纯。 糖因成本太高而限制了其大规模的商业化生产¨1。 1．3基因拼接构建目的序列 因此。用D．甘露糖异构酶将D一果糖转化为昂贵的 D．甘露糖可以大大减少生产成本，具有应用前景和 17377)内的D．甘露糖异构酶氨基酸序列旧1，用在线 市场潜力。 目前，关于D一甘露糖异构酶的研究多见于国外 dnaworks／)设计适合在大肠杆菌内表达的甘露糖异 的报道一。41，大多利用野生菌株直接进行发酵来生 构酶(Fmi)基因序列，片段全长1245 bp。设计的 产D．甘露糖异构酶。本文利用基因拼接技术怕1，得 Fmi基因拼接引物共36条，其中相邻的2条寡核苷 到表达D．甘露糖异构酶的目的基因，并构建了D一甘 酸有16bp相互互补，上下游引物末端分别加上Nde 露糖异构酶的诱导表达载体，转入大肠杆菌内表达， I和Sac I酶切位点用于后续亚克隆。参考Xiong_。 摸索其最优催化条件，获得了D-甘露糖异构酶的高 等的方法，扩增出Fmi基因。 效表达。 1．4 Fmi克隆载体的构建 1 材料与方法 将切胶回收的Fmi片段和pUCA·T质粒载体用 TOPl0感