家蝇3种半胱氨酸蛋白酶抑制剂的鉴定和功能分析.pdf

摘 要 摘 要 半胱氨酸蛋白酶抑制剂（cystatin ）是一类广泛存在于各种生物体内的蛋白酶抑制因 子，参与多种生物学及病理学进程。家蝇 Musca domestica 常常生活在在病原菌滋生的 恶劣环境中，具有很强的适应能力，了解其独特的免疫及发育调控机制，将为研究昆虫 生理、免疫以及杀虫等方面提供新的途径。 本论文以家蝇为研究对象，研究内容主要分为 5 个部分： 第 1 部分：通过转录组数据分析、RT-PCR 及 RACE 技术从家蝇幼虫体内克隆获得 3 个不同半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的 cDNA 序列，经过同源分析，将其分别命名为： Mdcystatin A （MdCYA ），Mdcystatin B1 （MdCYB1 ）和Mdcystatin B2 （MdCYB2 ），并对 其氨基酸序列进行了分析； 第2 部分：以家蝇管家基因β-actin 及 GAPDH 作为内参分子，利用实时定量RT-qPCR 对经大肠杆菌（Escherichia coli ）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ）刺激，不 同组织，不同发育阶段，不同营养条件下MdCYA ，MdCYB1 和 MdCYB2 基因的 mRNA 表达水平进行定量分析； 第 3 部分：构建了家蝇 MdCYA ，MdCYB1 和 MdCYB2 基因的原核表达载体，并在 大肠杆菌 DE3 体内进行诱导表达，以木瓜蛋白酶为底物，分析了重组蛋白的蛋白酶抑 制活性。 第 4 部分：用 rMdCYA 蛋白免疫新西兰大白兔制备了抗血清，利用免疫组化技术 分析了 MdCYA 在家蝇幼虫体内的分布情况。 第 5 部分：应用 RNA 干扰技术，饲喂家蝇幼虫能表达 dsRNA 的细菌，有效抑制虫 体中靶基因的表达，分别研究 MdCYA 和 MdCYB1 基因在变态发育中所起的功能。 研究结果： （1）MdCYA 基因 cDNA 全长 416 bp ，包含一个 357 bp 的完整开放阅读框（ORF ）， 根据 ORF 推导的 MdCYA 多肽由 118 个氨基酸残基组成，SignalP 3.0 程序预测 N 端包 括 17 个氨基酸残基的信号肽，MdCYA 成熟肽由 101 个氨基酸残基组成，理论分子量 为 10.8 kD，理论等电点为 5.37 。同源性分析表明，与棕尾别麻蝇Sarcophaga peregrina 的 Sarcocystatin A 相似性最高（identity=51% ）。 I 摘 要 MdCYB1 基因 cDNA 全长 607 bp，编码 123 个氨基酸残基，N 端包含 22 个氨基酸 残基的信号肽，成熟肽由 101 个氨基酸残基组成，理论分子量为 11.3 kD，理论等电点 为 9.23 。同源性分析表明，氨基酸与红尾肉蝇S. crassipalpis 的 Sarcocystatin B 具有最 高相似性（identity=62% ）。 MdCYB2 基因 cDNA 全长 400 bp ，编码 110 个氨基酸残基，N 端不存在信号肽，理 论分子量为 12.2 kD，理论等电点为 6.10 。同源性分析表明，氨基酸与红尾肉蝇的 Sarcocystatin B 具有最高相似性（identity=58% ）。 （2 ）RT-qPCR 分析表明在分别被大肠杆菌和金黄色葡萄球菌刺激后家蝇幼虫体内 MdCYA 表达量明显下调，而 MdCYB1 和 MdCYB2 基因表达量在刺激后显著上调，分别 在 48 h 和 6 h 达到高峰，MdCYB2 可能参与家蝇幼虫的免疫调控，MdCYB1 很可能是由 于家蝇幼虫受到刺激而后准备提前化蛹，从而引发 MdCYB1 表达量的升高；组织定量 分析表明，3 种基因均在脂肪体与血细胞中有较高水平的表达；在不同发育阶段中， MdCYA 在化蛹阶段表达量最低，而 MdCYB1 和 MdCYB2 在此时期表达量最高，提示该 3 种基因在调控变态发育中扮演不同的角色；在不同营养条件下该 3 种基因均无显著变 化。 （3 ）