日本血吸虫TβRII基因全长cDNA克隆及胞外段免疫保护功能研究.pdfVIP

广州医学院硕士论文 日本血吸虫TβRII 基因全长cDNA 的克隆及其胞外段免疫保护功能的研究 日本血吸虫TβRII 基因全长cDNA 的克隆及其 胞外段免疫保护功能的研究 专 业：免疫学 硕士生：陈 姗 导 师：李 孜 副教授 马长玲 副教授 广州医学院病原生物学与免疫学教研室 中文摘要 日本血吸虫病(Schistosomiasis)是一种严重危害人类健康的人畜共患寄生虫 病，虫卵沉积于肝、肠等组织中形成虫卵肉芽肿及其纤维化是虫体致病的最主要 原因。目前，血吸虫病疫苗的研制是血吸虫病防治工作的重点之一。 转化生长因子β （transforming growth factor-β，TGF-β）超家族成员在细胞 [1-8] 的生长、分化、细胞外基质的形成和免疫调节等方面都发挥着重要作用 ，且 [9] TGF-β1 是目前公认的最强的肝纤维化促进因子之一 。TGF-β 在日本血吸虫 （Schistosoma japonicum ，S.j ）自身的生长发育过程中，以及在虫体与宿主的相 互作用中都发挥着重要作用[10] 。TGF-β超家族包括一系列具有类似的结构和功能 的生长因子家族肽类。TβR （TGF-β受体）有多种，其中I 型（TβRI ）、II 型（TβRII ）、 III 型（TβRIII ）分布于多类细胞膜上。TβRI 和TβRII 在TGF-β信号转导中起主 导作用，TβRII 具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性，在生理浓度下可单独与 TGF-β 结 合，结合后TβRII 胞内段结构发生改变，再与TβRI 结合形成TGF-β-TβRII-TβRI 复合体，随之TβRI 胞内段发生磷酸化，引起下游smad 蛋白家族的一系列变化， 从而将信号传递于细胞胞核内[11,12] ，调控目的基因表达。由此推测 SjTβRII 在 SjTGF-β 的信号转导中亦发挥着重要的枢纽作用。曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni S.m) TβRII 可通过激活TGF-β信号通路诱导抱雌沟蛋白（Gynecophoral canal protein,GCP ）表达，表明其在雄虫促雌虫发育成熟方面起着重要作用，提 1 广州医学院硕士论文 日本血吸虫TβRII 基因全长cDNA 的克隆及其胞外段免疫保护功能的研究 示TβRII 可作为疫苗候选分子。 研究目的： 鉴于SjTβRII 在虫体TGF-β的信号转导中可能发挥着重要的枢纽作用，以及 作为疫苗候选分子的潜在性，本文拟用分子生物学等技术，获得 SjTβRII 全长 cDNA ，并对其编码序列进行生物信息学分析；克隆和原核表达胞外段 （SjTβRIIout ），且对表达产物进行免疫活性检测；将重组蛋白免疫动物，评价其 免疫保护性效果；测定SjTβRII 在成虫、虫卵中的定位和转录水平。 研究方法： （1）SjTβRII 基因全长 cDNA 序列由上海英潍捷基生物技术（Invitrogen ）有限 公司通过RACE 方法扩增获得。利用GeneBank ，ExPASy 等对该基因序列进行 生物信息学分析，设计特异性引物，提取成虫总RNA 进行RT-PCR ，对SjTβRII 基因全长编码基因（ORF ）进行特异性PCR 扩增、TA 克隆。 （2 ）特异扩增 SjTβRII 基因胞外段（SjTβRIIout ），亚克隆至原核表达载体 pET28a(+) ，构建 pET28a(+)-SjTβRIIout 重组质粒，并转化至大肠杆菌 BL21 （DE3 ）。经IPT