人脐带间充质干细胞定向诱导分化为胰岛β样细胞及治疗1型糖尿病的实验的研究.pdfVIP

头大学医学院第二附属医院放免室测定)。 (2)共同培养诱导分化 ①大鼠胰腺细胞的分离培养：无菌条件下取新生大鼠胰腺除去包膜结缔组织，置于预冷的D-Hanks X 止消化，1000r／rain离心5min，用10％FBS1640反复吹打成细胞悬液，以l106密度接种予培养瓶中，每 3---4d换液一次。 X ②大鼠胰腺细胞与HuMSCs共培养：以l106个的密度将第四代HuMSC接种予六孔板底层，加入3ml 细胞，使其与底层细胞共培养，其中insert的孔直径0．39m。注意观察细胞形态变化，每3～髓换液一次。 TotalRNA 大鼠胰腺细胞共培养3、6、14d后的HuMSCs。按照RNA simple RTKit进行。引物序列(同前面)。 步骤按照Quantscript 2．3 HuMSCs体肉诱导分纯及鉴定 构橼酸缓冲液溶解)，注射药锈后每隰3天从尾静脉采盘测定隧祝盘糖。3次血糖嵩于16。7mmol／L，定先 糖尿病大鼠。 细脆混悬滚，移檀备用。 X 位备皮，75％溪精湾毒，将上述标记好的5--一8106个HuMSCs霜0。3--0。5mlPBS重悬细胞并吸入lml注 射器缓慢注入尾静脉。 (4)HuMSCs的然内定攘：移撼HuMSCs1个月后取糖尿病大鼠胰腺组织及肝脏行快速冰冻切片观 察，荧光显微镜下观察HuMSCs在体内的定植情况。 (5)免疫组织化学鉴定人胰岛素抗原的表达：取移植羼的大鼠胰腺及脬脏行快速冰冻切片，免疫组 化鉴定入胰岛素的表达，详细步骤参考北京中杉免疫组化试剂盒说明书． TotalRNA (6)RT-PCR检测移植HuMSCs后糖尿病大鼠胰腺的人胰岛素基因表达：按照RNA simple RT QuantscriptKit进行。Insulin基因及fl-actin引物序列同前。 (7)HuMSCs对糖尿病大鼠的疗效观察；动态观察糖深病大鬣的盔糖、体重及存活率；移植前后大 鼠胰腺组织病理切片HE染色观察胰妫的形态改变。 3统计学处理采用SPSSl0．0统计软件进行统计分祈，组阁纥较采糯t检验。 结 果 1体外诱导分化结果 1．1药耪诱导分佬结果 (1)形态学观察脐带组织块培养1周左右，可以看到组织块贴壁、生长，细胞呈纤维状，在组织 块周围可有缨胞球形成。1014d君缨胞可长潢培养板的80％左右，帮可传代培养。传找后的缨胞仍呈纤 维状生长。第2代以后的细胞生长较迅速，每3～5d可传代一次，直到第10代左右，细胞生长速度逐渐 一勰3一 变慢，并蹙宽大。经药物睫导后，细胞j目态开始出现童化，部分细胞由原来的纤维状连新转变为类圆形 多角形厦不规则形，音】：分细胞转变成小岛团状(目1) 图1 醇诱导后形态f}}现变化，部丹细胞形态LtI成纤维样变为多角形、椭圆形，部分转娈成小岛团状(光镜×200)。 色，而对照组则没有表达(址图2)。 (3)RT-PCR鉴定胰岛素盐PDX．1基凶结粜胰岛素基圳、PDX1基W的表达请M未诱导的细胞 后可检测到胰岛素基吲的表逃(目3)。 6davs 12davs PDX．1 165bD InsuIll 221bo 0．actin 39