HPV16型L2全长及其氨基端(1-200)原核融合蛋白的表达和交叉反应特性的研究.pdf

一 里塑堕堂堕堡主堂垡笙奎 长融合蛋白作为包被抗原，采用间接ELISA法检测标本中的HPV血清特异 性IgG抗体，并分析了该蛋白在检i贝f]HPV感染的宫颈癌及尖锐湿疣患者血清 特异性抗体的敏感性和特异性。 筛选出临床常见的HPV6、11、16、18、31、33等14种型别间具有高度保守 性的L2氨基端(1-200)，并通过分子生物学技术构建和表达该段序列的原核 融合蛋白，并经SDS．PAGE和WB方法鉴定。 16、18型)间的交叉反应特性；同时收集98例尖锐湿疣患者、135例宫颈癌 患者和96例健康对照者血清，通过ELISA方法检测标本中的HPV血清特异 性IgG抗体，并分析该蛋白在检i贝I]HPV感染的宫颈癌及尖锐湿疣患者血清特 异性抗体的敏感性和特异性。 结果： 1．成功构建了重组质粒PGEX．4T-1．HPVl6L2，并较高效地表达了含有HPVl6 L2全长基因的原核融合蛋白，其表达量占总蛋白的27．2％；SDS．PAGE和 WB检测结果显示在相对分子质量约82x103Da处可见特异性阳性信号条 带。 2．采用HPVl6 L2全长融合蛋白免疫家兔，在全程免疫后产生了高效价的 HPVl6 L2特异性抗体，最高滴度达1：256000。通过WB检测该抗体可与 HPVl6L2融合蛋白在相对分子质量约82x103Da处可见特异性阳性信号条 带。 L2 3．以HPV6、11、16和18DNA阳性患者血清为一抗的WB结果显示，HPVl6 全长融合蛋白在相对分子质量82x103Da处均出现特异性阳性信号条带。 ELISA结果显示，尖锐湿疣组、宫颈癌组和健康对照组血清抗体吸光度值 92．3％和6．0％。3组间血清抗体彳值及阳性率差异均具有统计学意义 著性差异(P0．05)。基于该蛋白的ELISA用于检测尖锐湿疣组敏感度为 3 一 堡型堕兰堕堡圭堂笪笙茎 92．3％(144／156)，特异度为94．0％(94／100)。 4．采用DNASTAR软件，对HPV共40种型别的L2氨基酸序列进行比对分析， L2 73型别间均具有较高同源性的氨基酸区域，即HPVN端1．200氨基酸序 52．7％彳4．3％。通过分子生物学技术成功构建并表达了含有HPVl6L2氨基端 (1．200)氨基酸序列的融合蛋白。 5．经WB分析HPVl6 染型别间具有良好的交叉识别特性。ELISA结果显示，该蛋白在检测尖锐 湿疣组、宫颈癌组和健康对照组血清IgG抗饷值分别为(o．753--．0．262)、 湿疣组与宫颈癌组比较无显著性差异俨O．05)。基于该蛋白的ELISA血清学 对宫颈癌组诊断的敏感性为88．8％(120／135)，特异性为90．6％(87／96)。 结论： L2 1．采用PGEX．4T．1表达载体成功构建并表达了未经密码子优化的HPVl6 全长基因的融合蛋白；可通过亲和层析法纯化了引入6×His标签的HPVl6 L2融合蛋白，同时经过WB和ELISA检测结果提示该蛋白的抗原性未受影 响。 2．通过原核HPVl6L2全长蛋白抗原免疫家兔，可成功制备高效价的特异性血 L2抗原的免疫学的初步研究提供了实验基础。 清抗体，为HPV 3．经WB结果提示，HPVl6L2全长蛋白可在临床常见高危型和低危型别即 该蛋白作为ELISA诊断试剂抗原在检测尖锐湿疣及宫颈癌患者血清HPV特异 性抗体中均具有较高的敏感性和特异性。 4．采用生物信息学方法，获得了具有较高保守性的HPVL2氨基端(1-200)的 4 温州医学院硕士学位论文 达