假单胞杆菌pcs-突变株构建和HrpZ基因克隆、表达与抗体制备.pdf

摘要 磷脂酰胆碱(PC)作为膜磷脂的一种组份与其它磷脂、膜蛋白以及其它成分相互作 用共同组成细菌的膜系统，维持细菌在特定条件下的生理代谢和行使其特定的生物学功 能。膜磷脂中PC含量的增加或减少必将改变细胞膜的生理生化特性，直接或间接地影响 细胞膜、细胞膜外层分子乃至整个细胞的生物学功能。细胞膜中PC缺失或掺入还有可 能影响贯穿细菌内膜和外膜的III型分泌系统的功能，也有可能影响毒性蛋白的合成和 转运。因此，本实验通过构建Pseudomonas pCS-菌株，克隆、表达、纯化毒性蛋白基 因hrpz，并制备多克隆抗体，以检测PC的缺失对毒性蛋白hrpz在细菌体内的表达和分 泌是否具有影响。从而进一步说明细菌细胞膜PC的合成对细菌致病力的影响。 胆碱合酶(pcs)基因，进行序列比对，找出pcs基因同源性比较高的保守区域，并设 计简并引物，以实验室在土壤中筛选到的Pseudomonas593总DNA为模板，PCR扩增出 Pseudomonas593 杂交的方法克隆出该菌pcs的整个基因序列。通过亚克隆将克隆的pcs基因插入到表达 593基因组 克隆到的pcs基因具有生物活性。然后利用同源重组的方法将Pseudomonas DNA上的pcs基因敲除掉，构建得到pcs缺陷菌株Pseudomonas Pseudomonas 593pc门≮能。在相同条件下比较两种菌株在不同Na+离子浓度，SDS浓度， triton 相当，当Na+离子浓度小于2％时两种菌都能较好的生长，而当Na+离子浓度大于2％时两 种菌都很难生长。在对不同去垢剂的耐受性性上，Pseudomonas 嬲都要强。 Hrpz蛋白作为假单胞杆菌主要的毒性蛋白，在假单胞杆菌的植物致病性上起着重要 的作用。根据已经报道的丁香假单胞菌丁香致病变种(Pseudomonassyringaepv． Van伪』J)的Hrpz基因序列设计引物，以丁香假单胞菌丁香致病变种的基因 syringae I 蛋白，从1L细菌培养物中可纯化出14mg蛋白。然后将纯蛋白免疫兔子，制备多克隆 593。Pseudomonas593 pcs——， 关键词：磷脂酰胆碱合酶 磷脂酰胆碱 基因敲除 毒性蛋白hrpz Ⅱ Abstract a ofmembrane the Phosphatidylcholine(PC)，ascomponent bacterialmembrane with andother systemtogetherphospholipids，membraneproteins thebacteria’S metabolismundercertainconditions components，maintainingphysiological and their functions．Locatedoutsideofthe the specificbiological headof PC bilayer,the isdifferentPE molec／比le from intermsofbiochemicalnature．Theincreaseor molec／比les decreaseofPCwill the and