酿酒酵母YS2-△adh2-△ald6突变株的构建及hxt1基因的过表达.pdfVIP

摘要 摘 要 生物质能源是化石能源良好的替代品，乙醇作为比较理想的可再生液体燃料备 受国内外科学家的亲睐。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)作为传统乙醇生产主要 用菌，选育其高产菌株一直是燃料乙醇生产的关键因素。其中，应用重组DNA和 分子改造技术有目的地改变酵母表达调控网络和已有代谢途径，优化细胞代谢机制， 构建优良性状工业微生物显得尤为重要。 本研究依据酿酒酵母本身高效的同源重组机制，应用过表达和基因敲除技术， 增强合成底物代谢利用率，降低或阻遏乙醇分解代谢流，成功构建双基因缺失突变 突变株。取得以下研究进展： l、以adh2基因缺陷型酿酒酵母YS2一△口砌2为出发菌株，应用长侧翼同源两 同源重组，之后转入表达质粒pSH65到阳性克隆中j半乳糖诱导表达Cre重组酶切 低18％，乙醇最高产量提高12．5％。生理特性试验表现为突变株具有很高的遗传稳 定性，生长情况不受影响。 ORF I酶切位点引物将hxtl 2、在pSH47质粒的基础上，通过设计分别带有EcoR 升较快，其他方面没有显著差异，遗传稳定性高。发酵检测，突变株 酵周期分别提前了3小时和8小时；乙醇产量较YS2菌株提高了12．65％。 中文文摘 中文文摘 在化石能源储量日趋减少，环境污染问题日益加剧，能源需求和石油价格持续 上涨的背景下，世界各国都在积极开发利用可再生的绿色清洁能源。燃料乙醇以其 污染小、经济可行、原料来源广泛等特点作为目前大规模替代石油的可再生能源， 受到国内外普遍关注。在我国，开发利用新能源和可再生能源，已成为调整和优化 能源结构、解决环境污染问题的国家战略。目前，燃料乙醇研究可分为三大类：菌 种选育研究、发酵工艺研究、特殊需要的基因工程菌构建。 cerevisiae)做为传统的乙醇生产菌株，具有乙醇耐 酿酒酵母(Saccharomyces 受性强，发酵工艺成熟，工业应用范围广泛，与其它微生物比较生物安全性好等特 点。同时，酿酒酵母是第一个基因组完成测序的真核生物，遗传背景非常清楚，由 于其体内具有高效的同源重组机制，在分子和基因水平进行操作非常容易。在实际 工业生产中，为了降低发酵工艺成本、实现高效的转化率和产出率，菌种的优劣在 整个生产流程中尤为重要。因此，菌种的选育必须以降低生产耗资与高产出为原则。 近年来，依据代谢工程理念，应用分子生物学手段对酿酒酵母进行分子育种是主要 的研究方向，其中，尤为突出的是重组DNA技术。应用代谢工程理念使用基因工 程手段对菌种改造过程中，敲除或过表达特定基因可以阐明该基因功能，改变代谢 途径，从而提高目标产物产量。同时，该突变株为进一步探索目的基因的转录调控 机制、基因与蛋白质相互作用以及分子信号传导通路等提供了理想材料，并为进一 步从基因和分子水平改进酿酒酵母乙醇代谢途径，构建优良性状高产乙醇生产菌奠 定了基础。本研究利用酿酒酵母细胞内的同源重组机制，运用基因敲除和过表达技 术，降低了由乙醛生成乙酸的分解代谢流，并在此基础上增强了己糖代谢率。与原 始出发菌株相比，不仅提高了乙醇产量，而且缩短了发酵周期，提高了发酵产率。 研究内容如下： 醛生成乙醇功能，而乙醇脱氢酶Adh2p其生物学功能却催化乙醇生成乙醛。本工程 中心利用基因敲除技术成功构建了adh2基因缺陷型突变株，该菌株在发酵后期乙醇 合成代谢稳定，乙醇分解利用率低于出发菌株。乙醛脱氢酶VI(ald6)是乙醛脱氢 V 福建师范大学王艳尊硕士学位论文 酶家族ACDH的一种，其基因编码乙醛脱氢酶Ald6p，执行生物催化乙醛至乙酸的 生物学功能，是糖酵解过程中乙酸发酵的关键酶。在酿酒酵母adh2基因缺失基础上 敲除ald6基因，有望降低乙醛至乙酸分解代谢流，从而使更多的乙醛转化生成乙醇。 本研究采用长侧翼同源两步PCR(删．PCR)方法构建ald6基因敲