引物的合成和纯化.docVIP

FAQ:引物的合成和纯化 1. 引物是如何合成的？ 目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺y三酯法。该方法具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。主要是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3端向5端合成的，相邻的核苷酸通过3→5磷酸二酯键连接。 固相亚磷酰胺三酯法合成引物的具体步骤如下：1) 将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5-羟基的保护基团DMT，获得游离的5-羟基。2) 合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3端被活化，5-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5-羟基发生缩合反应。3) 带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。4) 在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。 经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。 通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过RPC、PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩，脱盐，沉淀。沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。 2. DNA合成粗产物中含有什么杂质？ 主要是合成反应过程中产生的失败片段以及脱保护基团时产生的铵盐。 3. 引物纯化方式有哪些？ 引物常用的纯化方式C18脱盐、RPC纯化、PAGE纯化、HPLC纯化。 纯化方式 详细说明 C18柱脱盐 又称为简易反相柱，对DNA有特异性吸附，可被有机溶液洗脱，但不会被水洗脱，因此能有效地去除盐分，但不能有效去除比目的片段短的小片段。该方法一般不会对普通PCR反应产生影响。对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。 RPC纯化 RPC纯化是通过反相净化滤芯 (Reverse Phase Cartridge) 对引物进行纯化，纯化原理与反相HPLC纯化一样。与反相HPLC比较，RPC是一种有效并且更加经济的纯化方式。反相净化滤芯通常包含一种疏水基质如 C18的硅胶，能够很好的吸附DNA，并且可以用水轻松地将切割下来的保护基团和短的引物片段从反相柱上洗掉。RPC纯化的引物可以应用于DNA测序、PCR及基因合成等。 PAGE纯化 PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对引物DNA进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法，纯化后的DNA纯度大于90%，对长链Oligo DNA (大于50 mer)的纯化特别有效。 HPLC纯化 HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理，对引物DNA进行纯化。该方法用于分离纯化或分析时能达到很高的纯度和灵敏度。在引物DNA的分析和纯化中，常用的有离子交换（ion-exchange）HPLC和反相（reverse-phase）HPLC。reverse phase HPLC：纯度大于90%；ion exchange HPLC：纯度大于95%，可以有效的去除N-1短片段。HPLC纯化主要用于短链和修饰引物的纯化。该法的缺点是成本较高，批量生产效率不高。 4. 引物纯化方式如何选择？ 引物纯化主要方法的适用范围及建议 您可以根据您的实验需求，选择合适的金斯瑞引物纯化方式，更加经济方便。如果您需要进一步的指导，请联系金斯瑞技术支持。 应用 引物长度要求 纯度级别要求 一般PCR扩增 45 base DSL 45 base PAGE 诊断PCR扩增 40 base RPC, PAGE DNA测序 20 base左右 PAGE 亚克隆，点突变等 根据实验需要 RPC, PAGE, HPLC 基因构建（全基因合成） 根据实验需要 PAGE 反义核酸 根据实验需要 PAGE 修饰引物 根据实验需要 PAGE, HPLC 5. 合成的引物5’端是否有磷酸化？ 合成的引物5’端为羟基，没有磷酸基团。如果需要，您可以用多核苷酸激酶进行5端磷酸化，或者要求我们合成时直接在5或3端进行磷酸化，需要另外收费。 6. 最长可以合成多长的引物？ 引物越长，出现问题的概率就越大。除非有特殊需要，我们建议合成片段长度不要超过80 mer,按照目前的引物合成效率，80 mer的粗产品，全长引物的百分比不会超过40%，后续处理还会丢失很多，因此最后的产量很低。金斯瑞最长可合成110 base的引物。 7. 为何长链引物的收费