低能N%2b注入介导秦艽基因组DNA转化酵母研究.pdf

IIIIIllUlllIIIIIIII UIIFIII Y2307770 Z冱纪TO眦DNA 在易M7魏^么彪彳巴积勿噬刃ZZ。4 TRANSFoRM蜘oN姗。月旌川＆留忱勿诸 删扬M玖记115：五诸舳UCEDBYN+D田阿。ANTATION AThesisSubmittedto Shaanxi of Scienceand University Technology inPartial Fulfillmentofthe Requirements forthe of Degree Masterof Science Engineering By Yunfang— Fu Thesis Supervisor：Pro￡XiangjunQi Doct．WeidongQian 2013 May 低能N+注入介导秦艽基因组DNA转化酵母的研究 摘要 药用植物秦艽(GentianamacrophJ／a,G 材的主要指标，具有抗氧化、抗炎、保肝、利胆及抗肿瘤等作用。近年来， 临床用药量的增加、多年的过渡采挖，造成了野生秦艽资源的严重匮乏。人 工栽培存活率低，药材质量下降，受季节变化影响明显，龙胆苦苷产量低等 问题导致龙胆苦苷的供应难以满足临床应用的需要。因此，迫切需要寻求及 扩大龙胆苦苷新型药源途经来满足其日益增长的需求。随着低能离子注入生 物工程学的发展，低能离子注入因其独特的反应机制及诱变效应，使其在微 生物、植物育种及农作物改良方面具有广泛的应用前景。 优化，建立了两阶段温度调控发酵法生产GSH。在此基础上，对N+注入 利用低能离子注入技术介导秦艽基因组DNA转化酵母，构建产龙胆苦苷的 酵母工程菌，为解析龙胆苦苷生物合成基因提供实践材料，为后续探索遗传 改造微生物生产倍半萜类物质提供理论和数据支持，对开展药用植物基因资 源开发和保护具有重要意义。研究结果如下： (1)建立了一种提高谷胱甘肽产量的方法。通过单因素试验确定了 pH，其分别为30℃、37℃和pH6．5；接着，通过变温调控分批发酵，确定 Cell 大培养，生物量(Dry GSH的产量。 (2)分别以注入后酵母细胞的存活率及产龙胆苦苷能力为依据，确定 8(HPl8)， 已申请保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)，保 藏日期为：2012年9月29日；保藏号为：CGMCC．NO．6642。 (3)建立了产龙胆苦苷酵母工程菌的快速筛选方法。首先采用颜色反 应进行定性分析，然后采用TLC及RP．HPLC法进行定量检测，具体如下： a颜色反应 2487；流动相为甲醇： C1R柱(250mm×4．6mm，59m)；紫外检测器：Waters