鼠疫耶尔森氏菌PhoP-RovA+psa转录调控环路与研究%3b正确作者%3a张义全%3b正确导师%3a宋亚军.pdfVIP

鼠疫耶尔森氏菌PhoP．RovA节s口转录调控环路研究 摘要 鼠疫是由鼠疫耶尔森氏菌(以下简称鼠疫菌)引起的一种自然疫源性疾病。鼠疫菌在 传播环节中宿主动物的改变以及致宿主病变的过程中，受到诸多环境信号，比如抗菌肽、 温度、pH、渗透压等的刺激，鼠疫菌能感应这种复杂的信号刺激并自我调节，产生毒力冈 子，最终使鼠疫菌得以存活。鼠疫菌自我调节机制中，转录调控子对靶基因在转录水平上 力相关因子，它们之间联系至今并未被阐明。 性环境以及抗菌肽的刺激信号，从而激活PhoP蛋白的转录调节活性，上调或下调靶基因的 转录。本实验室前期研究发现，鼠疫菌PhoP蛋白是整体调控子，表达谱结果表明，在低 基因。 小肠结肠炎耶尔森氏莴加鲥缺失株对小鼠毒力下降，表明RovA是其重要的毒力调控 因子。RovA能以二聚化的形式结合到靶基因启动子区调控基因转录，在小肠结肠炎耶尔 森氏菌和假结核耶尔森氏菌中，它不仅能激活侵袭因子基因砌v的表达，还能激活自身的表 达以及其他毒力相关基因的表达。在鼠疫菌中，也有学者进行了RovA的芯片表达谱分析， 发现RovA是一个全局性毒力调控因子，能调控数十个基因的表达，包括pH6抗原基因，但 是详细调控机制还没见报道。 高表达是在环境pH=6、温度在34℃或更高条件下实现，且只有在34℃以上才能发挥毒力 效应。pH6抗原是鼠疫菌的毒力相关因子，与腺鼠疫的发生密切相关。 根据表达谱和生物信息学预测，在转录水平上，PhoP对芦刎、芦葩、自身操纵子基因 以及，D谢可能具有调控作用，同时RovA对自身基因及卵训、卵葩的转录也可能具有调节 作用。本研究的目的在于阐明上述调控子对可能的靶基因的调控机制。 我们基于Red系统分别构建了鼠疫菌p办DP和加俐基因的突变株，利用大肠杆菌 (EMSA)、DNase I足迹实验、D．半乳糖苷酶报告基因融合实验(Lacz实验)以及引物延 伸实验等来详细研究PhoP和RovA对各自靶基因的转录调控机制。 实验结果表明：在低M92+、对数生长中期条件下，在转录水平上PhoP抑制芦利、p葩、 下，在转录水平上PhoP抑制p蒯的表达，而对其它所研究基因无影响；在对数生长中期， 中文摘要 较pH7．2条件下高表达，但是温度对其无影响。 在加诩基因启动子区发现了两个转录起始位点，分别命名为Pl和P2，其中Pl靠近翻译 的影响；DNaseI足迹实验表明RovA对自身启动子区有两个亲和力不等的结合位点sitel 控是双重性质的。 在筇葩启动子区分别得到了PhoP和RovA的结合位点，并发现了三个距离很近的转录 点位于其上游而远离转录起始位点，体内实验也证明，在特定条件下PhoP对筇以转录具有 抑制作用，而对阳谢具有激活作用。 PhoP和RovA对邵训启动了的结合位点互相重叠，都位于转录起始位点之后，体内实 通过竞争声洲启动子区相同的结合位点，共|一调节ps刎的转录。 明了这种调控关系，同时也证明了PhoP确实正调控自身的转录，但是所发现的两个转录起 始位点P1和P2，在细菌生长对数中期时只有P2是PhoP依赖性的。 综上，本研究利用分子生化试验手段，首次揭示了鼠疫菌中的PhoP．RovA．筇口转录调控 录，而激活自身操纵子的转录，PhoP也能感应酸性信号，抑制筇别的转录；ps刎的转录调 节还受酸的调节，pH5．8较pH7．2条件下高表达，但是温度对其无影响。 关键词：鼠疫耶尔森氏菌；转录调控；PhoP；RovA；脚位点 II 英文摘要 ofthe of Molecularcharacteriza，tion regulation transcriptional PhoPandRoVA 脚口by in毙坶砌砌p缈f括 Abstract