胸膜肺炎放线杆菌自转运黏附素序列分析及其黏附活性和研究.pdfVIP

胸膜肺炎放线杆菌自转运黏附素序列分析及其黏附活性研究 中文摘要 胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae ，APP ）是引起猪传染性胸膜肺炎 疾病的病原菌，在世界范围内广泛流行，并且是严重危害养猪业的传染病中重要的传染病之 一。2009 年，Auger 等进行 APP 体外黏附猪肺上皮细胞实验时，发现一个新基因上调表达， 与流感嗜血杆菌自转运黏附素 Hsf 具有较高的同源性；在许多细菌中的自转运黏附素具有 一定的免疫保护作用，其中以自转运黏附素成功开发出商品化的高效疫苗，最典型的是百日 咳杆菌的 pertactin（PRN）作为一种疫苗组分添加，pertactin 是疫苗产生抗体水平提高、 减低百日咳感染的重要因素。因为 APP 中同样具有三聚体自转运黏附素，所以尝试利用百日 咳的疫苗案例进行研究。APP 具有众多血清型，其致病力和免疫原性各不相同，主要血清型 间无免疫交叉保护，是制约 APP 致病机理和疫苗研究的瓶颈，严重影响了 APP 的诊断、检疫 和预防。为寻找有效的诊断、检疫和预防的新方法，本研究选择 APP血清 2、4、6、8、9、 10 型菌株为研究对象，以 GenBank报道的 APP血清 5b 型自转运黏附素基因（CP000569.1， 500018-510061bp）设计引物，通过 PCR 的方法寻找该基因，经生物信息学分析并预测各血 清型三聚体自转运黏附素功能区，寻找到血清 8 型功能区完整，并将其功能区命名为 adh 基因进行克隆与序列分析，对该 adh 基因进行原核表达，同时进行昆明小鼠抗 APP 感染进行 免疫保护性测定，验证 adh 重组融合蛋白免疫保护性，并用凝血酶切除该重组融合蛋白的 GST 标签，纯化 Adh 蛋白，并检测 Adh 蛋白是否对猪肺上皮细胞具有黏附活性。结果表明， 血清 2、4、6、8、9、10 型的自转运黏附素的基因具有较大差异，发现血清 8 型与血清 5b 型自转运黏附素氨基酸序列同源性达到 92%，氨基酸推导序列同源达到 82%；并成功获得融 合蛋白 GST-8Adh，实验表明该蛋白及其抗体具有抑制 APP 对猪肺上皮细胞的黏附作用，并 且对血清 4、8 型保护力达到 9/10，对其他血清型保护不明显，但也有一定的保护能力。本 研究证明了 APP 中三聚体自转运黏附素可以作为基因工程疫苗的候选靶位，并且为今后 APP 不同血清型新型多价疫苗研究、致病机理研究的建立提供必要的基础。 关键词：胸膜肺炎放线杆菌；三聚体自转运黏附素；PCR；Hep_Hag；Ylhead 论文类型：A（基础研究） III 胸膜肺炎放线杆菌自转运黏附素序列分析及其黏附活性研究 Abstract Actinobacillus pleuropneumoniae (Actinobacillus pleuropneumoniae, APP) pleuropneumoniae is caused by disease pathogens, widely popular in the world, and is a serious infectious disease in the pig industry against important infectious diseases. 2009, Auger, etc. APP lung epithelial cells in vitro adhesion experiments, we found a novel gene up-regulated expression, and Haemophilus influenzae Hsf adhesin from a transfer of high homology; in many bacteria in the adhesin from a transfer have some protective immunity, which has developed from a transfer out of adhesin and effici