烟草中及RNA干扰抑制子HC-pro互作蛋白的鉴定.pdf

摘要 制RNA干扰的分子机制．我们试图利用马铃薯Y病毒的HC-pro为诱饵蛋白，通过酵母双杂交从 烟草cDNA文库中筛选出与RNA干扰有关的蛋白因子。利用Clontech公司的酵母双杂交试剂盒， 在宿主萤AHl09中，通过酵母菌的自我重组把烟草叶片的cDNA文库构建在cDNA文库载体 半乳糖苷酶活性检测，共有136个克隆显示a—x．半乳糖苷酶活性。在这136个克隆中，共测出 共转化到酵母菌AHl09中，在四缺培养基上作进一步的筛选和a—x-半乳糖苷酶活性检测，有20 个cDNA质牧表现互作阳性，分别命名为szl—sZ20．通过核苷酸和氮基酸序列比较．发现除了2 个未知功能蛋白外，其余的互作阳性因子大致可分为4类：一类是参与植物光合作用和碳水化合 物代谢的蛋白。如：参与叶绿体分裂的ParA家族的ATPase、参与三羧酸循环的转酮醇酶、参 与TC^循环乌头酸酶、多糖磷酸化酶和果糖激酶；第二类是一些与植物抗逆有关的因子，有山梨 醇脱氢酶、真菌及伤口诱导蛋白BARWiN、过氧化氢酶catalose以及半胱氨酸蛋白酶等：第三类 是参与基因转录、翻译和蛋白代谢的蛋白因子，有多锌指结构蛋白、20SProteasomebeta亚基、 I)NA聚合酶家族蛋白等；第四类是有关氨基酸和氮代谢的酶。有天冬氮酸蛋白酶、谷氨酰胺合成 酶、胺氧化酶、丝氨酸／苏氨酸脱氢酶等。挑选互作阳性相对较强的SZI和SZ2cDNA质粒作为重 点研究。 多锌指结构蛋白，含有8个COIC锌指结构．N端是连续的lcS序列，在第7和第8个锌指结构之 氨酸变为甘氨酸，第35位由天冬氨酸变为组氨酸。 利用与SZ2核苷酸序列高度同源的番茄基因的核苷酸序列设计出5’端引物，用SZ2的cDNA 设计出3’端引物，通过RT-PCR扩增SZ2 cDNA全长，核苷酸和氮基酸序列比对结果表明：SZ2 是20SProteasome蛋白酶复合体的beta亚基。 转化酵母菌株INVScI，经过D_半乳糖诱导表达后，提取酵母菌总蛋白进行免疫共沉淀。实验结 果表明，SZl和SZ2都能与llC-pro蛋白互作。 性蛋白。 SZI和SZ2与植物RNA干扰之问的联系正在继续研究。 关键词：HC—pro，RNA干扰，酵母双杂交，锌指结构蛋白，proteasome，免疫拭沉淀 Abstract PVYisa RNAj f}lC-pro)of potent suppressor．To Pot／viraihelper-componentproteinase mechanisminwhichthe RN灿．weusedthe as themolecular HC-presuppresses HC-pro inv髂tigate in baittoScreenfor tobaccoeDNA a lfbrary interactingproteins妇a yeasttwo-hybridsDtem．1飞e constructedwiththefull Pw fusedwiththe bait was length HC-pro pGBKT7DNA-binding plasmid leaf thenwastransferredintothe SUajnsY187．11”tobacco domain(pGBKTT-HC-pro,Tip+)．andyeast totheGAL4activation