来自耶鲁大学的PCR常见问题的精辟总结.pdfVIP

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2015-10-15 发布于重庆
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来自耶鲁大学的PCR常见问题的精辟总结

中国试剂网 3.12.1.36 来自耶鲁大学的PCR 常见问题的精辟总结 the table below. All reactions are run for 30 cycles. COMPONENT VOLUM FINAL E CONCENTRATION 1.autoclaved ultra-filtered water20.7µL - (pH 7.0) 2.10x PCR Buffer* 2.5µL 1x 3.dNTPs mix (25 mM each 0.2µL 200 µM (each nucleotide) nucleotide) 4.primer mix (25 pmoles/µL each 0.4µL 0.4 µM (each primer) primer) 5.Taq DNA polymerase (native 0.2µL 1 Unit/25 µL enzyme) 6.genomic DNA template (100 1.0µL 100 ng/25 µL ng/µL) * The 10x PCR buffer contains: 500 mM KCl; 100 mM Tris-HCl (pH 8.3); 15 mM MgCl2 (the final concentrations of these ingredients in the PCR mix are: 50 mM KCl; 10 mM Tris-HCl; 1.5 mM MgCl2). QUESTIONS SOLUTIONS 1. I get (many) longer unspecificDecrease annealing time products. What can I do? Increase annealing temperature Decrease extension time Decrease extension temperature to 62-68º C Increase KCl (buffer) concentration to 1.2x-2x, but keep MgCl2 concentration at 1.5-2mM. 中国试剂网 3.12.1.36 Increase MgCl2 concentration up to 3-4.5 mM but keep dNTP concentration constant. Take less primer Take less DNA template