不同种属乙羟基酸合成酶亚基间相互作用的研究.pdfVIP

摘要 摘 要 乙酰羟基酸合成酶(Acetohydroxyacid 2．2．1．6)是细菌、 synthase[AHAS]，EC 真菌和植物内支链氨基酸生物合成途径中的一个关键性的酶。研究表明AHAS 具有重要的农学意义，它是目前多种商品化除草剂的作用靶标。但除草剂过度、 单一和长期大面积的使用也引发了杂草抗性问题。因此充分利用已经被实践证 明了的超高效除草剂靶酶AHAS，发展新型绿色农药，是一个很值得关注的课题。 研究表明，不同来源的AHAS全酶由催化亚基和调控亚基组成。其中催化 亚基含有酶催化中心，AHAS的活性位点位于催化亚基二聚体界面上；调控亚基 则调控酶活性及稳定性，并授予酶对支链氨基酸反馈调控的敏感性。因此，AHAS 催化亚基和调控亚基间的相互作用以及催化亚基之间的聚合作用对酶行使全部 机制极为重要。我们大胆设想AHAS催化亚基与调控亚基之间以及催化亚基之 间的作用界面很有可能成为潜在的除草剂靶标，靶向这些亚基间作用界面可以 开发新型的绿色农药。 本论文中我们采用化学生物学手段来研究这两种重要的亚基相互作用，主要 包括以下三方面的工作： 一、构建了烟草AHAS及酵母AHAS催化亚基和调控亚基基因表达体系， 摸索并建立了拟南芥、烟草和酵母AHAS蛋白的表达纯化体系。 二、通过酶活性和酶动力学性质测定来研究不同种属(大肠杆菌、拟南芥、 烟草和酵母)AHAS催化亚基和调控亚基间同源或异源的重组作用。结果表明基 因表达体系和蛋白表达纯化体系构建成功，调控亚基可以成功激活同源催化亚 拟南芥AHAS催化亚基之间可以实现异源激活，说明了AHAS催化亚基与调控 亚基的作用界面具有一定的保守性，为我们研究该界面提供了重要信息。 三、本文基于已报道的拟南芥AHAS催化亚基晶体结构，设计并构建了破 坏拟南芥AHAS催化亚基聚合界面氢键作用的突变体。通过酶活性和酶动力学 性质测定研究发现：突变体较野生型而言，活性都有很明显的下降，R142A和 N600A两个突变体甚至失去了活性，而且部分突变体的动力学性质也发生了明 显的改变。这说明催化亚基聚合界面的确是关乎AHAS酶学性质的重要区域。 I 摘要 另外，我们还通过凝胶排阻实验观察到了R142A突变体的明显解聚，因此我们 认为R142A活性的丧失可能就是因为突变造成催化亚基解聚产生的，揭示了 R142位点的重要性。 关键词：乙酰羟基酸合成酶；催化亚基；调控亚基；亚基作用 II Abstract Abstract a inthe Acetohydroxyacidsynthase(AHAS，EC2．2．1．6)iskeyenzyme ofbranched-chaina／RillOacid．AHAShasbeenidentifiedtobe biosynthesis very to O／leofthemosthot of commercial importantagriculture，it’s targetsmany herbicides．Butthe and useofherbicideshasalsoledto excessive，repeated long-term weed to full the resistance wanttake USeof