捕食性真菌-Duddingtonia+flagrans胞外蛋白酶诱导与纯化及其性质的研究.pdf

摘 要 为确定捕食线虫性真菌-Duddingtonia flagrans 分泌产生胞外蛋白酶的最佳培养基 及诱导物，并对胞外蛋白酶的生化性质进行研究。本论文首先利用含不同诱导物的 LMZ 培养基、枸椽酸培养基及大豆蛋白胨培养基，分别对 Duddingtonia flagrans 进行 培养，将产生的发酵液过滤后，测定其蛋白质含量、蛋白酶及磷酸酶活性，并用发酵 液进行杀虫试验；在确定Duddingtonia flagrans 产生胞外蛋白酶的最佳培养基及诱导 物的基础上，利用其培养 Duddingtonia flagrans 并收集发酵液，然后分别用硫酸铵盐 析粗提发酵液中的胞外蛋白质，对粗提物进行蛋白质含量、蛋白酶活性、磷酸酶活性 及杀虫作用的研究，确定盐析沉淀粗提胞外蛋白质的最佳盐浓度；在此基础上，收集 胞外蛋白质粗提物，通过 SephadexG-100 分子筛对其层析纯化，并检测酶活性，继而 对纯化的具有酶活性的胞外蛋白质即胞外蛋白酶进行生化性质研究。 结果显示：1.用不同诱导物和培养基培养 Duddingtonia flagrans ，其发酵液中蛋白 质种类、浓度、蛋白酶和磷酸酶活性及杀虫作用显著不同，其中马圆线虫诱导的枸椽 酸培养基发酵液蛋白质种类和含量最多，蛋白酶和磷酸酶活性最高，杀虫作用最强。 此外试验还证实 Duddingtonia flagrans 发酵液不仅具有杀线虫活性，而且也具备杀蝇 蛆作用。2.采用不同盐浓度从Duddingtonia flagrans 发酵液中盐析粗提的蛋白质性质和 种类不同，其中硫酸铵饱和度在 45%～65% 的粗提物蛋白质含量最高、种类最多、酶 活性与杀线虫作用最强，且硫酸铵不会破坏胞外蛋白质的结构与活性。3.被纯化的 3 种胞外蛋白酶分子量约为 63KDa、38KDa、19KDa，这 3 种胞外蛋白酶酶活性的 pH 和温度范围都比较大，其最适 PH 为 6.5、最适温度为 50℃。不同酶抑制剂对 3 种胞 外蛋白酶抑制作用不同。其中菲罗啉和抑肽素对分子量 63KDa、19KDa 的胞外蛋白酶 抑制作用很强，而 PMSF 对分子量 38KDa 的胞外蛋白酶抑制作用很强。 上述研究成果不仅证实了不同诱导物及培养基可影响 Duddingtonia flagrans 的代 谢过程，而且还表明 Duddingtonia flagrans 发酵液中含有杀虫物质，这为今后进一步 研究捕食线虫性真菌的化学杀虫机理提供了重要参考依据，也为研究开发捕食线虫性 真菌胞外蛋白酶生物制剂及其应用奠定了基础。 关键词：Duddingtonia flagrans；胞外蛋白酶；诱导；纯化；性质研究 Study of Induction, purification and characteristics of extracellular protease from Duddingtonia flagrans Abstract To define the best media and induction agent of Duddingtonia flagrans secreted the extracellular protease and study the biochemical properties of the exoprotein. In this essay , LMZ medium and citric acid medium and soy peptone medium, which respectively contein different inductors were used to culture Duddingtonia flagrans. The fermentation broth filtrations were collected later, the protein content, enzyme activity, phosphatase activity were evaluated, and then toxicity of the broth filt