产球毛壳甲素真NK-36b中Gα的功能研究.pdf

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产球毛壳甲素真NK-36b中Gα的功能研究.pdf

摘要 摘要 本实验室已从柏树枝中分离筛选到一株腐生真菌NK-36b,其发酵产物经过 TLC法初步鉴定,HPLC定性定量检测,以及质谱和核磁共振谱进一步确定,证 明了该菌的发酵产物中含有大量的球毛壳甲素,产量高达83mg/L。实验证明, NK.36b在以杨树叶子为唯一碳源的培养基上生长良好,可以在刚果红培养基上 可产生水解圈,这些结果表明该菌同时具有降解纤维素的能力。这些特殊的 NK-36b的生物学功能让它在应用领域具有巨大的潜力,所以我们需要通过分子 生物学的方法对它进行研究来了解其代谢途径的分子机制。 G蛋白是真核生物中一类很重要的信号蛋白,控制调节着很多代谢通路,如 MAPK级联反应和cAMP信号通路,能够将环境中的信号传导到细胞内调控细 胞的代谢。G蛋白是由Ga,Gp,研三个亚基组成的。据文献报道,Ga基因在 里氏木霉(Trichodermareesei)中调节纤维素酶的表达,影响碳源代谢;Ga基 因也被报道影响拟枝孢镰刀菌(F淞anum 基序列,文献报道,丝状真菌中Gal和Ga3基因最为保守,因此选择敲除这两 个基因来研究Got亚基在NK-36b中的功能。 本论文通过PCR扩增得到Gal和Ga3基因的同源片段,构建了敲除质粒 中。利用潮霉素(hyg)和双丙氨磷(bar)选择压力来筛选转化子,通过PCR, Southern 除重组子Gal基因的表达水平,结果发现CHD4的Gal基因的表达水平显著下 降。在表型方面,利用DNS的方法检测发酵液中的CMCase的酶活含量;并通 过HPLC来检测发酵液中球毛壳甲素的产量,结果发现在CHD4中随着Gal基 因表达水平的下降,菌株降解纤维素的能力以及球毛壳甲素的合成能力均显著 降低。表明Gal基因对NK.36b次级代谢产物的合成和纤维素酶的形成起着重 要作用。 关键词:NK.36b;m;球毛壳甲素;纤维素降解;基因敲除 Abstract An fromthebranchof fungus,NK-36b,isolated sp.in endophytic Cupressus been to of t083 China,hasprovedproducehi曲yieldchaetoglobosinA(CTBA),up thin liquid mg/Lby layerchromatography(TLC),highperformance andnuclear resonance chromatography(HPLC),massspectrometry magnetic wellintheculturemedium theleavesof (NMR).Growingvery containing Populus carbon and zones in red the resource sp.as only hydrolyseappearingCongoagar mediumdemonstratethatNK·36bisof in cellulose. greatcapacitydegrading G is of Ga,Gp,研subunits.111eyregulatemultiple

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